实时荧光定量PCR法检测蛋白原液外源性DNA残留量方法的研究文献综述

一、研究背景

目前，厦门万泰生物技术有限公司正在开展重组乙型肝炎疫苗临床前研究工作，为了能够满足后续的产品申报，需要进行蛋白原液外源性DNA残留量的检测，需要建立一套适用的检测方法。本课题计划采用实时荧光定量PCR法建立蛋白原液外源性DNA残留量检测方法，并通过方法验证得出结论，判断该方法能否运用于本公司重组乙型肝炎蛋白原液DNA残留量的评价。

二、研究目的

建立重组乙型肝炎蛋白原液外源性 DNA 残留量的实时荧光定量PCR检测方法。

三、进度安排

1、进行预实验：评价使用ABI7500荧光定量PCR仪及其软件的适用性。

2、使用SYGNUS E.coli宿州细胞DNA提取及扩增试剂盒提取多批次重组蛋白原液残留的外源性DNA，作为后续定量实验的供试品模板。

3、使用SYGNUS试剂盒中的标准E.coli宿主DNA作为标准品并进行梯度稀释成梯度标准模板，使用大肠杆菌DNA国家标准品或试剂盒的标准E.coli DNA稀释低、中、高三个梯度（在标准曲线浓度范围内），通过相对偏差评价测量方法的准确度。

4.采用将SYGNUS E.coli DNA标准品与供试品DNA溶液混合使标准品稀释至某个指定浓度，记混合液为A。同时测定同稀释倍数的供试品溶液，记为B。通过计算加入的标准溶液浓度的回收率评价测量准确度（回收率=（A溶液浓度-B溶液浓度）/理论的指定标准溶液浓度100%，回收率最好在80%~120%）。

5、专属性验证：取大肠杆菌DNA、酵母菌DNA、植物基因组DNA或其他DNA材料作为供试品同时进行实验，应证明仅大肠杆菌DNA可获得定量结果，其他种DNA不反应或反应微弱，能表现出该方法的特异性。