基于全基因组扩增的核酸定量研究文献综述

1. 选题背景和意义：

现代社会中，核酸扩增在基因鉴定、疾病诊断、生物研究、案件侦查等各种方面中被大量运用，并发挥着重要的作用。而聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction）和多重链置换扩增技术（multiple displacement amplification，MDA）则是几种相当常用的核酸扩增方法。

聚合酶链式反应用于扩增一小段已知的DNA片段，通常不超过10kbp。在PCR的过程中，反复循环温度引发的变性-退火-延伸三个阶段的反应使得 DNA 序列中的特定片段被特异性结合的上下游引物与酶不断扩增，并且新生成的 DNA 链也可以作为模板进行下一轮的扩增，这使得 PCR 扩增技术的效率达到指数级别。

基于PCR中核酸数量呈指数增长的原理，在反应体系中加入荧光染剂实时观测反应过程中 DNA 浓度的变化的方法，称为即时聚合酶链式反应（Real-time polymerase chain reaction，又称qPCR）。通过测量PCR 反应荧光“抬头”时间可以用于判断起始核酸浓度。

虽然在引物设计得当、反应条件适宜的条件下，PCR 扩增反应可控而高效，非常适合对于特定核酸序列的扩增，但是PCR的设计上是用来扩增10kbp以下的短序列的，不适合用于长核酸序列（如基因组序列）的扩增。长核酸序列的扩增往往使用全基因组扩增技术（whole genome amplification，WGA）。

多重链置换扩增技术（multiple displacement amplification，MDA）是一种常用于全基因组扩增的非特异性 DNA 扩增技术。其通过完全随机生成的引物（长度多为 6bp）结合在模板链上的不同位置，分别进行延伸来达到随机扩增模板序列全长的目的。MDA有着以下几种优点：反应为恒温反应，不需要复杂的仪器也可以顺利进行反应，对仪器设备的要求较低、MDA 中使用的 Phi29 聚合酶具有极高的保真度，复制错误率仅有约10^-7，适合用于检测碱基尺度的突变和变异、引物序列是完全随机合成的，理想状况下 MDA 对于不同序列的扩增是没有偏好性的、在MDA中，已扩增的核酸在被“顶”下模板链后，又能够成为新的模板被扩增，所以扩增效率很高。

由于MDA具有无偏好性、常温下也可反应、扩增效率高（指数效果）等优势，可以推测其具有不分序列地定量微量核酸的潜力。但同时，MDA也存在一定的问题，由于其链置换特性和PCR不同，与PCR相比，其扩增原理还没有非常清晰的刻画，也不能用来进行核酸的定量。这就是本课题想要解决的问题。

1. 课题关键问题及难点：

本课题的核心问题是建立荧光实时MDA体系，并优化实验条件。在此基础上，可以解决的问题有根据得到的荧光曲线，建立模型，分析抬头时间与反应体系初始核酸浓度的关系，借此推算其定量关系、通过荧光体系，对MDA反应的不同阶段进行划分，推测各阶段荧光曲线的拟合公式以及进行普通qPCR反应实验，将所得到的荧光曲线与MDA反应体系所得到的荧光曲线进行对比，借助荧光曲线对MDA的扩增机理和PCR的扩增机理的异同进行比较等。

本课题的难点有：需要对相关知识有良好掌握，在自学的基础上加以灵活运用。同时需要将实验研究和数据分析结合，对综合运用知识和技能解决实际问题的能力有一定要求。

1. 文献综述（或调研报告）：

许多涉及基因分析的生物学和法医案件都需要对微量样品中的DNA进行测序，例如未经培养的单细胞中的DNA或从犯罪现场收集的少量组织中的DNA。常规的基于聚合酶链反应（PCR）的DNA扩增方法需要序列特异性的寡核苷酸引物和热稳定的（通常是Taq）聚合酶来从微量DNA产生大量DNA。但是，这对于使用基于测序的DNA分析的现代技术是不够的。因此，特别是在单细胞基因组研究中，需要一种更有效的非序列特异性方法来扩增微量DNA。

多重链置换扩增技术（multiple displacement amplification，MDA）是一种常用于全基因组扩增的非特异性 DNA 扩增技术，其采用链置换的方法，已扩增的核酸在脱离模板链后，又能够作为新的模板被扩增，因此扩增效率很高。这种方法可以将微量的DNA样品快速扩增至合理数量，用来进行基因组分析。该反应通过将随机六聚体引物退火至模板而开始：DNA合成是通过具有极高的保真度的聚合酶（通常是Phi 29 DNA聚合酶，其复制错误率仅有约~10^-7）在恒定温度下进行的，不需要复杂的仪器也可以顺利进行反应，对仪器设备的要求较低。与传统的PCR扩增技术相比，MDA可以产生大量产物，并且错误频率更低。该方法已在全基因组扩增中得到了积极应用。