绞股蓝分子鉴定研究文献综述

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

【拟研究的问题】基于DNA条形码分子鉴定策略，利用绞股蓝及其混伪品ITS2的序列特异性差异，区分绞股蓝与几种常见混伪品。利用叶绿体基因matK、rbcL、trnH-psbA三个基因的特异性差异，将同属不同种绞股蓝进行区分。采集不同产地绞股蓝，利用ITS2以及叶绿体matK rbcL trnH-psbA分析不同产地绞股蓝的基因差异，以期建立绞股蓝DNA条形码库，从分子层面区分绞股蓝道地性。

【采用的研究手段】从Genbank下载绞股蓝及其混伪品雪胆、锥形果、棒槌瓜、乌蔹莓、白蔹的ITS2序列；从Genbank下载8种绞股蓝叶绿体基因组，选择matK、rbcL、trnH-psbA三个基因序列进行比对；利用Vector NTI 11.5.1进行序列比对分析，利用MEGA4.0构建系统发育树。利用CTAB法对不同产地的绞股蓝以及乌蔹莓、广西绞股蓝药材进行DNA提取，基于DNA条形码技术利用ITS2以及matK rbcL trnH-psbA对绞股蓝进行分子鉴定。三、采用vectorNTI 11.5.1进行ITS2序列比对分析，利用MEGA4.0构建系统发育树。

【文献综述】

1.研究意义

绞股蓝（Gynostemma pentaphyllum(Thunb.) Makino）葫芦科、绞股蓝属草质攀援植物。又称天堂草、超人参、遍地生根、七叶胆、五叶参等，现代研究表明，绞股蓝的主要含有绞股蓝皂苷、多糖、黄酮类、氨基酸、微量元素等成分，且绞股蓝皂苷与人参皂苷具有相似的结构，是除五加科外少数被证实含人参皂苷成分的中药。绞股蓝具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、降血糖、降血脂、抗辐射、抗衰老等药理作用。由于绞股蓝具有多种药效及营养和保健功效，而且资源较多、价格便宜，具有十分广阔的开发前景。目前，绞股蓝已经被开发成一系列药食两用的中药类产品。

目前市场中绞股蓝药材混伪品有乌蔹莓 Cayratia japonica(Thunb.) Gagnep.的全草、雪胆Hemsleya chinensis的全草、棒锤瓜Neoalsomitra integrifoliola的全草、锥形果Gomphogyne cissiformis的全草、白蔹Ampelopsis japonica的全草等。由于绞股蓝为草类药材，质地松脆，在采收加工、干燥、运输及储藏的过程中易瘪、破裂，给鉴别带来困难。绞股蓝与其混伪品的鉴定研究多见于植物原形态及其粉末鉴别等传统中药鉴定方法，分子生物学水平上的鉴定少见。随着分子生物学的发展，DNA 条形码技术以其通用性强，稳定性和重复性高，有统一的操作标准和鉴定流程，不受被检测对象形态特征及发育阶段所限， 易于操作和推广等优点为中药鉴定领域密切关注，应用 ITS2 序列对绞股蓝及其混淆品进行鉴定，为准确、简便地鉴定绞股蓝提供重要的分子依据。已有部分ITS2序列部分数据的分析，本课题会增加一些种类一些种类全草类数据进行比较全面的数据分析。

目前市场中绞股蓝药材混有同属不同种绞股蓝，它们含有的有效成分含量不同导致药效各有不同。在绞股蓝分子鉴定方面，已有文献利用叶绿体3个基因构建出12种绞股蓝属植物系统发育树，12种绞股蓝属植物分别为：心籽绞股蓝G. cardiospermumensp;、ensp;疏花绞股蓝 G. laxiflorum、五柱绞股蓝 G. pentagynumensp;、翅茎绞股蓝G. caulopterum、广西绞股蓝G. guangxiense、ensp;扁果绞股蓝G. compressum、ensp;长梗绞股蓝G. longipesensp;、缅甸绞股蓝G. 'burmanicum'、毛绞股蓝G.pubescens、毛果绞股蓝G.pentaphyllum var. dasycarpum、光叶绞股蓝G. laxum。文献中同时提到与心皮发育相关的基因G-AGL29-like 基因能与叶绿体3个基因matK rbcL trnH-psbA达到相同的鉴别效果。但还未有对产地中绞股蓝药材是否纯种以及其混杂种的品类分辨的研究。由于经过炮制加工，药材中部分DNA部分发生降解，提取DNA难度增大，本研究拟采用CTAB法，适当延长提取时间，提高提取质量。

2.研究方法

1. 该研究应用 ITS2 序列对绞股蓝及其混淆品进行鉴定，为准确、简便地鉴定绞股蓝提供重要的分子依据。
2. 基于DNA条形码技术的叶绿体3个基因条形码鉴定：DNA条形码技术是近年来兴起的一种分子生物学鉴定方法，该方法利用基因组中一小段公认的、相对较短的DNA序列进行物种鉴定，区别于性状鉴定、显微鉴定等传统鉴别方法，DNA条形码技术具有准确性高、不受个体发育过程以及药用部位影响、鉴定门槛低、可建立DNA条形码库用于快速鉴定大量样本等诸多优点。目前DNA条形码技术已广泛应用于中药材鉴定，已经建立了植物类以ITS2为主体序列，动物类以COI为主体序列的中药材鉴定体系。该方法主要包括供试样品处理、DNA提取、PCR扩增、PCR产物测序、序列拼接以及结果分析等步骤。本研究拟采用该技术对绞股蓝同属不同种植物基于DNA条形码技术的叶绿体3个基因条形码鉴定进行DNA条形码鉴定，用CTAB法对不同产地绞股蓝药材进行DNA提取，前人从绞股蓝属新鲜植物中提取DNA，但还未报道有从药材中提取DNA并进行分子鉴定的报道。利用从文献中得到trnH-psbA短引物、matK短引物、rbcL短引物对提取的DNA进行PCR扩增，PCR产物用琼脂糖凝胶电泳回收，将回收产物测序然后对测序结果进行序列拼接，将获得的序列在中药材DNA条形码辨别绞股蓝品种。利用从文献中得到trnH-psbA短引物、matK短引物、rbcL短引物对广西绞股蓝提取的DNA进行PCR扩增，PCR产物用琼脂糖凝胶电泳回收，将回收产物测序，然后把测序结果与药材中得到的DNA序列进行对比，辨别药材中是否混杂该品种。

[1]秦双双，李海涛，汪周勇，等.绞股蓝属植物亲缘关系初步分析[J]。中国中药杂志，