基因工程肺炎支原体蛋白的纯化及鉴定文献综述

一．本课题的意义

肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae, Mp)是一种能在无生命培养基中生长的原核微生物，是引起原发性非典型肺炎的主要病原体，还可引起咽炎、鼻炎、中耳炎、支气管炎、气管炎等疾病，与小儿哮喘的发病也有密切关系。此外，Mp在机体内可逃避宿主免疫系统的监控、清除，引起持续性感染，导致机体器官发生慢性病理性损害，可引发动脉粥样硬化、冠心病等心血管疾病^[3]，所以Mp的研究受到广泛关注。肺炎支原体的诊断方法主要依靠分离培养和血清学试验。标本可采可疑病人的痰或咽试子，接种于含血清或酵母浸膏的琼脂培养基。5～10天后观察有无直径30～100um的圆形房顶样菌落。多次传代后可变为典型的“荷包蛋”样菌落，并能吸附多种动物红细胞和气管上皮细胞、HeLa细胞等，且此类吸附可被特异性抗体所抑制。分离的支原体经形态、溶血与生化反应作初步鉴定后需进一步用特异性抗血清作生长抑制试验和代谢抑制试验。用患者血清与支原体脂质抗原作补体结合试验，恢复期较急性期效价高4倍以上具有诊断价值。亦可用间接免疫荧光试验、间接血凝ELISA检测标本。另外，有1/3～3/4患者的血清可与人O型红细胞在4℃时有非特异性凝集（称为“冷凝集试验”），37℃时消失，患病一周时达到高峰。此方法简便，有助于诊断。目前临床上还没有能够有效预防和治疗由肺炎支原体引起的呼吸道疾病的药物。本课题主要研究设计肺炎支原体蛋白的基因序列，研究蛋白纯化的步骤，鉴定其相关性质。

二．研究的目标和内容

Mp在机体内可逃避宿主免疫系统的监控、清除，引起持续性感染，导致机体器官发生慢性病理性损害，可引发动脉粥样硬化、冠心病等心血管疾病.Mp没有细胞壁，主要通过细胞膜表面结构与宿主细胞膜上的受体结合，从而摄取合成其自身结构所需的氧基酸、游离脂肪酸、核酸前体等营养物质,因此，Mp对宿主细胞或组织旳黏附，是其致病的关键。Mp主要由三部分组成，分别是细胞主体、附植细胞器及丝状体尾部。Mp通过细胞膜上特殊的尖端结构( Top structure)（称为附植细胞器Attachment Organelle AO）伸入细胞膜而黏附至宿主细胞，而尖端结构中的膜蛋白(包括糖蛋白、脂蛋白等)通过酰基链锚定于细胞膜上，是黏附的物质基础

Mp的黏附细胞器主要由P1、P30、P116、高分子质量蛋白HMW（high molecular weight proteins）1-5，以及P90、P40、P65等黏附辅助蛋白组成，这些成分共同构成一个特征性的高电子密度“黏附蛋白复合体”。Mp的附植细胞器对宿主细胞的吸附能力取决于蛋白复合体各蛋白组分之间的相互协调。P1和P30主要聚集在黏附小体的顶端结构，能与呼吸道黏膜上皮细胞细胞膜上的神经氨酸（HA）受体直接结合，从而使Mp黏附到细胞表面。P116、HMW1-5等主要参与维持Mp顶端结构的完整性和稳定性，构成P1、P30等黏附蛋白聚集顶端结构的支架，在Mp吸附宿主细胞的过程中起辅助作用。Mp的发病机制被部分归因于过度的免疫反应，即通过黏附蛋白黏附到相关细胞表面，激发某种信号从而引起特异性细胞骨架的蛋白重排，穿过胞膜并在胞质中大量复制，最终导致宿主细胞损伤死亡。但黏附作用与免疫反应之间的相互作用机制目前尚不清楚，猜想可能与细胞分裂、分化、黏附作用、滑行运动等有关。170KDa的P1蛋白含有多个抗原决定簇，可在肺炎病人中引起强烈的免疫反应，是MP免疫诊断的优选抗原。目前国内外已有人成功构建了Mp P1蛋白的表达载体，用其检测临床标本，有较高的特异性和敏感性。但是P1黏附因子和生殖支原体140 kDa蛋白之间有共同抗原，与真核生物结构蛋白也有一定同源性，所以用完整的肺炎支原体菌体成分或完整的P1蛋白作抗原易出现非特异性交叉反应，而且P1黏附蛋白的羧基端仅含有三个预测抗原表位，相对于全菌抗原来说抗原表位仍。P116蛋白为含有1030个氨基酸的Mp表面蛋白，也具有黏附特性和免疫反应性，其与生殖支原体之间的免疫交叉反应低。选取P116蛋白特异抗原表位区作为目的基因，与含有P1蛋白抗原表位的表达载体重组，将会增加重组蛋白的特异抗原表位，用于临床研究，有望提高诊断的敏感性和特异性。研究认为，机体对Mp感染的保护性免疫主要是依赖于体液免疫，但现在越来越多的研究发现，Mp可侵入宿主细胞中持续存在，因此细胞免疫对Mp感染有重要的免疫保护作用。

三．研究的方法

蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物中提取出来得到重组蛋白。分离纯化某种蛋白质，首先要把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来并保持原来的天然状态，不丢失生物活性。然后根据不同的情况，选择适当的方法，将组织和细胞破碎。组织和细胞破碎后，选择适当的缓冲液把所要的蛋白提取出来。细胞碎片等不溶物用离心或过滤的方法除去。当蛋白质提取液获得后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白与其他杂蛋白分离开来。样品经粗分级分离以后，一般体积较小，杂蛋白大部分已被除去。进一步纯化，一般使用层析法包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等。必要时还可选择电泳法，包括区带电泳、等电点聚焦等作为最后的纯化步骤。研究表明，Mp细胞表面的P1、P116黏附蛋白是肺炎支原体与宿主细胞受体结合的主要黏附蛋白，为MP致病的重要因素，也是刺激机体产生免疫反应的主要免疫原。但是研究显示，Mp 的P1 蛋白和P30 蛋白与真核细胞有同源性，且P1 蛋白与生殖支原体也有交叉反应 ，而通过基因工程方法制备的重组蛋白仅含有特异的抗原表位，可作为抗原诊断试剂用于临床血清学诊断，其固有优点是能提高诊断试剂的特异性。

参考文献：

[1] Blasi F, Tarsia P, Aliberti S, et al. Chlamydia pneumoniae and Mycoplasma pneumoniae[C] Seminars in respiratory and critical care medicine. Copyrightcopy; 2005 by Thieme Medical Publishers, Inc., 333 Seventh Avenue, New York, NY 10001, USA., 2005, 26(06): 617-624.