研究背景：内质网是真核细胞中蛋白质翻译合成和细胞内钙离子的储存场所，新生的蛋白质在分子伴侣的协助下进行折叠，只有正确折叠的蛋白质可以被转运到高尔基体。未折叠或错误折叠的蛋白质仍留在内质网，通过内质网相关降解（endoplasmic reticulum associated degradation,ERAD）机制逆移位至细胞浆并被蛋白酶体降解。近年研究发现，葡萄糖或营养物质缺乏、脂质过度负荷、病毒感染、药物、毒素和分泌蛋白合成增加等均可打破内质网的稳态，其功能紊乱时出现错误折叠与未折叠蛋白在腔内聚集以及钙平衡紊乱时的状态，称为内质网应激反应（endoplasmic reticulum stress,ERS）。
内质网应激是指由于某种原因使得细胞内质网生理功能发生紊乱的一种亚细胞器病理过程，一般是用未折叠蛋白来提示内质网发生了应激反应。正常情况下，内质网环境的稳定是实现内质网功能的基本条件，因此内质网具有极强的内稳体系。尽管如此仍有很多因素可导致内质网功能的内稳态失衡，形成内质网应激。例如缺血再灌注损伤、氧化应激、同型半胱氨酸（homocysteine,HCY）等化学物质处理、细胞内蛋白质合成过快以至于超过蛋白质折叠能力、内质网钙代谢紊乱、卵磷脂合成障碍等多种物理、化学或遗传因素等都可成为内质网应激的重要诱因。
未折叠蛋白反应（unfolded protein response,UPR）是通过内质网内的三种跨膜受体蛋白介导，分别是双链RNA依赖的蛋白激酶样内质网激酶（PKR-like ER kinase,PERK）、活化转录因子6（activating transcription factor 6,ATF6）和肌醇需酶1（inositol-requiring enzyme 1,IRE1）。在静息的细胞中，这三种受体的内质网腔内结构域均与内质网伴侣糖调节蛋白GRP78/Bip结合处于非活化状态。当未折叠蛋白在内质网腔内累积时，由于GRP78/Bip与未折叠蛋白有更高的亲和力，使得GRP78/Bip转而与未折叠蛋白结合，促使PERK、ATF6和IRE1的释放，从而依次激活这三种受体，触发UPR，促进细胞生存；活化的PERK促使真核生物起始因子2alpha;（eukaryotic initiation factor 2alpha;,eIF2alpha;）磷酸化，导致蛋白质整体翻译水平减弱，进而减少蛋白质的合成。ATF6激活后入核，结合于启动子内质网应激反应元件（ERSE），诱导内质网应激基因（GRP78/94、PDI、XBP1、CHOP等）的基因表达。IRE1激活后剪切X盒结合蛋白（XBP1）前体mRNA形成有活性的XBP1s。XBP1s不仅可以诱导内质网分子伴侣的转录而增加蛋白质的折叠能力，还可以加速错误折叠蛋白的降解。
如果应激过强或持续较长时间时，生存途径不能缓解ERS 引起的细胞功能失调，那么细胞凋亡途径就会被激活。（1） 转录因子GADD153 /CHOP 的激活转录:CHOP 也称为生长停止和DNA 破坏诱导基因153( growth arrest and DNA damage inducible gene 153，GADD153) ，是ERS 特异的转录因子，属C /EBP 转录因子家族成员。PERK、ATF6 以及IRE1 都能诱导CHOP 的转录，其中PERK-eIF2alpha;-ATF4 是激活CHOP 蛋白表达的主要途径。CHOP 主要是通过促进GADD34、ERO1alpha; 和TRB3 等的表达及下调抗凋亡蛋白Bcl-2 等促进细胞凋亡。（2）激酶ASK1 /JNK 的激活: 活化的IRE1 胞浆结构域通过募集接头分子的肿瘤坏死因子受体相关因子2( tumour necrosis factor receptor － associated factor2，TRAF2) 到细胞膜而激活凋亡信号调节激酶1( apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1 ) 形成IRE1-TRAF2-ASK1 复合物，既而激活c-Jun 氨基末端激酶( c － Jun N － terminal kinase， JNK) ，通过磷酸化调节Bcl-2 家族成员的活性而介导细胞凋亡。（3）Caspases 的激活: caspase-12 定位于内质网膜上，在生理状况下以无活性的酶原形式存在，当ERS发生时，caspase-12 酶原被激活。活化的caspase-12激活caspase-9 进而激活caspase-3 等效应caspases，最终诱导细胞凋亡。
ERSR可能与缺血再灌引起的细胞死亡密切相关。研究发现ERSR可以通过抑制再灌注损伤时细胞钙超载,减轻组织再灌注时的细胞损伤。心肌细胞含有丰富的肌浆网,肌浆网内维持适当的钙离子水平是心肌正常的兴奋收缩耦联功能所必需的。已有研究表明,再灌注损伤的发生机制之一是钙平衡紊乱,包括胞外钙内流失控、肌浆网储存钙释出增多,最终造成细胞钙超载。研究发现培养的心肌细胞肌浆网钙清空诱发内质网应激促使ATF6 从内质网向核的转位,激活SERCA2 ( sarco / endop lasmic reticulum calcium AT2Pase2)启动子的ERSE2,使SERCA2表达增加,将钙离子从胞浆转运至肌浆网,以恢复心肌细胞肌浆网钙水平。近期研究利用培养的心肌细胞H9c2以衣霉素( tunicamycin)预处理诱导内质网应激,发现H9c2细胞GRP78 mRNA水平和蛋白水平都升高。在长时间的ATP耗竭和氧化应激诱发的心肌缺血再灌注损伤条件下,衣霉素预处理组心肌细胞较对照组释放水平明显降低。深入研究发现:当用咖啡因和内质网钙泵抑制剂( thap sigargin)处理心肌细胞时,预处理组向胞浆释放的Ca2 水平明显高于对照组,表明内质网有更高的Ca2 储存。氧化应激前后预处理组细胞胞质的Ca2 水平的维持较对照组稳定。晚近研究利用基因微阵列分析了MCP大鼠(在心脏特异性的表达MCP21从而导致缺血性心脏病的大鼠模型)心脏的基因表达情况,发现内质网分子伴侣基因、ERAD相关基因、PD I家族的表达明显增强[ ,提示了内质网应激参与了缺血性心脏病的发生发展。缺血后处理( ischemic post2conditioning, I2postC)是一种新发现的缺血再灌注损伤的保护机制,通过增加蛋白的合成和阻止胞浆钙离子的升高来保护缺血再灌注心肌细胞。研究发现在心脏缺血再灌注模型中I2postC可以抑制calreticulin的表达和caspase212的活性。在缺氧再富氧新生小鼠模型中, I2postC上调了p38 APK的磷酸化,而抑制了JNK的磷酸化。说明I2postC的保护作用是通过减轻内质网应激起作用的[。以上结果表明预先诱发内质网应激可以通过改善再灌注损伤时细胞钙超载保护心肌细胞免受致命的损伤。所以对通过内质网应激研究可以为心肌缺血的治疗提供新思路和治疗靶点。
研究目的：1. 探讨内质网应激参与心电重构机制。
2. 掌握病变心肌细胞的造模方法以及Western-Blot的操作流程
3. 掌握电脑终端的蛋白分析
研究方法：一)制造大鼠病变心肌细胞模型
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