ROS响应型siRNA递释纳米载体的构建与表征文献综述

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

1. 研究背景

肿瘤在本质上是一种基因病，是机体在环境和遗传等致癌因素的影响下，局部组织细胞内的原癌基因被激活，而抑癌基因受到抑制^[1]，继而引起表达水平的异常，经历多阶段演变而形成的疾病，死亡率极高，严重威胁了人类的生命健康。如今临床上常用的治疗手段为手术治疗、放射治疗和化学治疗，这些疗法均无法根治肿瘤，病人体内残存的少数癌细胞仍会增殖复发。不仅如此，由于最常用的普通化疗的特异性较差，在杀伤肿瘤细胞的同时对普通细胞尤其是机体免疫系统也造成了伤害，对人体产生严重的毒副作用。如今，随着科学技术的发展，安全性好、效率高、毒副作用低的生物治疗逐渐成为医药领域研究的重心，其中基因治疗是生物治疗的一个主要方向^[2]。

基因治疗是指将外源正常基因导入靶细胞内，永久或暂时取代缺陷基因，从而达到治疗疾病的目的。在肿瘤的基因治疗中广泛应用了质粒 DNA、反义寡核苷酸、小干扰RNA（siRNA）等核酸。siRNA是一种含有21～23个碱基对的特殊双链RNA分子，可通过内涵体进入细胞内，从内涵体释放后解开双链，而后反义RNA与相关蛋白结合形成RNA诱导的沉默复合体(RNA induced silencing complex，RISC),RISC通过siRNA的引导识别并降解靶基因的mRNA，抑制特定蛋白的表达，在mRNA水平上诱发序列特异性的转录后基因表达沉默^[3-4]。在已进行的临床治疗试验中，已针对EphA2 癌蛋白^［5］、蛋白激酶 N3、核糖核苷酸还原酶M2亚基、Polo样激酶1、血管内皮生长因子^［6］等靶向基因设计了siRNA序列,验证了其对肿瘤在基因水平上干预抑制的效果，展现出了siRNA基因干扰在肿瘤治疗中的巨大潜力。

基因治疗体系包括治疗基因和基因传递系统两个部分，其中最关键的部分在于构筑高效的基因载体，如何提高基因输送的靶向性，开发高效低毒的基因输送载体是目前肿瘤基因治疗的一项重要挑战^［7］。在肿瘤的基因治疗领域，由于siRNA序列具有简单有效的优势，其递送载体的设计也吸引了人们越来越多的关注。由于siRNA 可被核酸酶快速降解和肾脏滤过，因此需要一个递送载体用于将其有效地运输到靶细胞，使其保持在血液循环系统中的稳定性以防止被核酸酶RNase 降解，以及网状内皮系统清除^［8］。目前,能够把治疗基因运输至靶细胞的载体主要分为病毒载体^[9](慢病毒、逆转录病毒与腺病毒等)和非病毒载体^[10](脂质体、阳离子型聚合物、胶束与纳米粒子等)两大类。 其中，转染效率更高的病毒载体是目前基因治疗临床实验中的主要研究对象。然而,其安全性问题是临床实验中的一大瓶颈，在临床实验中发现病毒载体可诱发白血病、癌症甚至诱发死亡事件^[11-13]。因此，相比于病毒载体安全性更高的非病毒载体逐渐获得人们的重视。在过去的几十年里大量的非病毒载体得到开发和研究，到目前为止，已研发出多种阳离子脂质、聚合物或无机纳米颗粒等递送制剂，用于将其递送至实体肿瘤，以保护脆弱的 siRNA 免受酶降解，避免被肾脏快速过滤以及吞噬细胞的截留，并进一步从血液外渗到肿瘤组织。

非病毒载体通常具有阳离子性质，主要可以分为阳离子脂质类和阳离子聚合物类两种。非病毒载体通过缩合核酸保护其不受核酸酶的降解，并且通过与细胞表面的电荷相互作用来促进细胞对核酸的摄取。一般情况下,阳离子聚合物将治疗基因运输至目标部位主要经历三个过程：(1)阳离子型的聚合物载体与阴离子型的目标基因通过静电相互作用自组装成复合物(polyplex)粒子，紧密的复合物结构可以很好地保护基因，防止其被核酸酶降解^[14]；(2)在生理环境中具有良好的稳定性的复合物粒子进入血液循环体系，为避免其在血液循环中发生解体或聚集，还需要有较长的血液循环时间；(3)复合物粒子需要顺利被细胞摄取, 进入细胞后，从内涵体和溶酶体中释放，目标基因在细胞内顺利释放并实现最后的基因表达。与病毒载体相比，非病毒载体转染效率相对较低，但是具有安全性高、制备简单并且容易大规模生产等优势，在肿瘤的基因治疗方面具有广阔的发展前景^[7]。

1. 研究目的与意义

本课题基于对肿瘤的基因治疗中所遇难题的研究与分析，设计了一种对肿瘤具有选择性且可高效转染的阳离子聚合物类非病毒载体。非病毒载体转染效率较低的主要原因在于阳离子聚合物将基因递送入胞后难以实现基因的有效释放，被困在载体中的基因逐渐被胞内多种核酸酶降解而失活。考虑到肿瘤组织处于乏氧环境而诱发细胞内活性氧蓄积，本研究基于苯硼酸结构易氧化及电子传递与结构重排原理，设计了ROS响应型siRNA递释纳米载体。

本研究中设计的ROS响应型siRNA递送载体，其最大的优势在于可以实现基因在ROS触发下的释放。在肿瘤组织的缺氧微环境中，细胞易蓄积活性氧，此时在ROS的作用下，载体聚合物降解，电荷湮灭，从而释放基因，进而达到肿瘤选择性基因高效转染。由于基因只有释放出来才会发挥生物功能，而其他的阳离子载体只具备基因转染能力，而不具备释放能力。因此我们研究的ROS响应型siRNA递送载体具有十分明显的优势与良好的发展前景。

1. 研究手段
2. 通过叔胺化与季铵化两种高分子反应步骤实施了聚乙烯亚胺（PEI）的季铵化，制备了季铵化的聚乙烯亚胺（QPEI）^[15]。
3. 在QPEI分子链上修饰加入苯硼酸结构，利用苯硼酸结构易氧化的特点以及电子传递与结构重排原理，得到我们所需的具有ROS响应性的siRNA纳米递释载体。
4. 采用红外光谱仪、核磁共振谱仪等现代分析仪器对所合成阳离子聚合物的结构进行表征。
5. 采用激光粒度仪、Zeta电位仪等手段对该聚合物纳米粒子的物理化学性质进行表征。
6. 参考文献

［1］ 田瑞敏，鄢佳程，王含彦，等.RNA干扰技术在肿瘤基因治疗中的研究现状［J］.重庆医学，2013，42(7) : 811-814．

［2］ Chen LH，Jia ZY.Precision medicine － the problems about study on cancer gene delivery［J］.Journal of Practical Oncology，2015，30(06) : 501 － 505．

［3］ FELLMANN C，LOWE S W．Stable RNA interference rules for silencing［J］．Nat Cell Biol，2014，16(1) : 10－18．