靶向寡聚体的近红外荧光探针设计合成与活性研究文献综述

一、研究背景

阿尔兹海默症(Alzheimers disease , AD)是一种原发性的神经退行性疾病，其发病机制十分复杂，目前的临床药物只能改善AD患者的症状，不能减缓疾病的发展过程，更不能从根本上治疗。AD 的主要病理特征是 beta;-淀粉样蛋白（beta;-amyloid, Abeta;）在细胞外沉积成老年斑以及由磷酸化 tau 蛋白在细胞内形成的神经纤维缠结(neuronal fibrillary tangles, NFT)、神经元丢失和脑中 Tau 蛋白沉积[1]。其中以Abeta;为主要致病因子的Abeta;假说一直占据重要地位。Abeta;的存在形式有单体、寡聚体和Abeta;纤维，由 39-43 个氨基酸构成的单体 Abeta; 先聚集成寡聚体，并进一步直接聚集成为更高分子量的 Abeta; 纤维。研究表明，可溶性的Abeta;寡聚体（包括二聚体、三聚体、六聚体、十二聚体等）对神经细胞具有高毒性[2]，在AD的发病过程中起关键作用。基于目前缺乏有效的早期诊断策略，因此在可以检出AD临床症状时，毒性形式的Abeta;往往已经造成不可逆转的神经损伤[3]。因此，寻找简便有效的早期诊断方法对于防治AD有重要意义。

目前，近红外荧光染料已经在肿瘤诊断、荧光成像、生物标记[4]等诸多领域发挥着重要作用。光学探针成像具有高选择性、高分辨率、无创实时等优点，越来越多的小分子探针被开发用于多种疾病的早期诊断和治疗等。且近红外（600-900nm）荧光成像用于生物成像时具有组织自荧光干扰小、组织穿透力强等优点，具有巨大的应用潜能[5]。开发有效检测Abeta;的近红外荧光探针有助于AD的早期诊断并及时进行干预。而以往的多数靶向Abeta;的荧光探针，比如广泛使用的硫磺素T（ThT），主要以检测 Abeta; 纤维为主，不能或不能区别识别 Abeta; 单体和寡聚体。研究和开发能特异性检测Abeta;寡聚体的小分子近红外荧光探针具有很大的潜力，对于在分子水平上研究AD的病理生理过程以及AD的早期诊断具有重要意义。

二、研究目的

以PTO-29为骨架结构，寻找针对Abeta;寡聚体的选择性更高的近红外成像探针，在前期工作的基础上[6]，以Abeta;单体和Abeta;聚合物的结构差异为切入点，利用计算机辅助设计，设计、合成选择性结合可溶性Abeta;寡聚体的小分子近红外荧光探针，为新型AD检测和治疗试剂的开发提供全新的思路和方法。

三、研究内容

1 计算机辅助设计

根据文献报道，Abeta;三聚体是由三个U 型发夹首尾相连形成环状的蛋白[7]，其核心片段多暴露于寡聚体表面；而Abeta;斑块是非环状蛋白，其三维结构中存在着狭长的U型孔道，核心片段多暴露于孔道中；另外，Abeta;寡聚体表面的疏水性残基数量多于Abeta;斑块，这是其毒性高的主要原因。这些差异为我们设计靶向Abeta;寡聚体探针提供了重要依据。根据Abeta;单体和Abeta;聚合物的结构差异，结合计算机模拟分子对接研究，在一字结构CRANAD-54平面结构中引入大位阻基团，形成V型结构，从而阻碍探针分子进入Abeta;斑块孔道中并且与Abeta;寡聚体表面疏水区域发生pi;-pi;堆积和范德华力作用，提高对寡聚体的选择性。在前期工作的基础上，以PTO-29为骨架结构设计一类靶向Abeta;寡聚体的荧光探针。

2 合成路线设计

参考PTO-29的合成路线，结合基本理论知识和文献报道的方法，设计并理解目标化合物的合成路线。下面为PTO-29合成路线:

Reagents and conditions: (a) 1-ethyl-4-iodobenzene, K2CO3, CuI, L-Pro, DMSO, 90C; (b) BF3Et2O, tributyl borate, r.t.; (c) tetrahydroisoquinoline, acetic acid, toluene, 65C.

3 合成实验

合成目标化合物，通过核磁共振氢谱、碳谱、高分辨质谱进行结构确证

4 性能测试

对制备的荧光探针进行荧光光谱测试和光学性质的考察，体外蛋白结合评价及Abeta;寡聚体靶向结合能力评价

① 荧光探针对Abeta;寡聚体的荧光响应试验

对比荧光探针与Abeta;寡聚体共孵育前后的光学性质的变化，包括发射波长的变化、荧光强度的变化等。

② 对Abeta;寡聚体亲和力检测

为考察探针与Abeta;的亲和力以及检测灵敏性，用不同浓度的Abeta;蛋白滴定探针溶液，测定探针与Abeta;寡聚体和聚合体结合的 Kd

③ 对Abeta;寡聚体靶向性检测

将探针分别与Abeta;单体、寡聚体、聚合体和BSA共孵育，检测探针荧光强度改变的情况。与Abeta;寡聚体共孵育组荧光强度增强的程度比其他组大，则表明探针对Abeta;寡聚体有选择性；另外，将探针分别与Abeta;单体、寡聚体和聚合体在野生型小鼠脑浆中共孵育，检测探针荧光强度改变的情况。与Abeta;寡聚体共孵育组荧光强度增强的程度比其他组大，则表明在生理环境下探针对Abeta;寡聚体有选择性

④ 细胞毒性、血浆中稳定性、血脑屏障透过性

要实现探针的在体成像及在早期检测中得到应用，还需要满足低细胞毒性、良好的血浆稳定性和可接受的血脑屏障透过的要求。选用SH-SY5Y细胞进行MTT试验考察探针的细胞毒性。将探针和小鼠血浆37℃下共孵育60min，通过HPLC检测探针稳定性。选用野生型小鼠，静脉注射探针，30min后通过荧光光谱和MS结果评价其血脑屏障透过性

⑤ 在体成像

试验选用4 月龄 APP/PS1转基因小鼠作为研究对象，应用年龄匹配的野生型小鼠作为阴性对照，静脉注射后采用近红外小动物成像仪记录图像以测试探针与 Abeta; 寡聚体在小鼠体内结合的特异性，判断能否用于检测幼小鼠的体内成像

四、工作计划

2月12日～2月29日:确定选题，进行相关文献调研；

3月1日～3月20日:撰写开题报告；

3月21日～5月31日：合成路线设计、开展合成实验以及活性研究；

6月1日～6月10日：论文写作，毕业答辩

五、参考文献

[1] D.J. Selkoe, Alzheimers disease: genes, proteins, and therapy, Physiol Rev, 81 (2001) 741-766.

[2] CLEARY J P, WALSH D M, HOFMEISTER J J, et al. Natural oligomers of the amyloid-protein specifically disrupt cognitive function [J]. Nature Neuroscience, 2005, 8(1): 79-84.

[3] R.A. Sperling, P.S. Aisen, L.A. Beckett, D.A. Bennett, S. Craft, A.M. Fagan, T. Iwatsubo, C.R. Jack, Jr., J. Kaye, T.J. Montine, D.C. Park, E.M. Reiman, C.C. Rowe, E. Siemers, Y. Stern, K. Yaffe, M.C. Carrillo, B. Thies, M. Morrison-Bogorad, M.V. Wagster, C.H. Phelps, Toward defining the preclinical stages of Alzheimers disease: recommendations from the National Institute on Aging-Alzheimers Association workgroups on diagnostic guidelines for Alzheimers disease, Alzheimers Dement, 7 (2011) 280-292.

[4] S. Luo, E. Zhang, Y. Su, T. Cheng, C. Shi, A review of NIR dyes in cancer targeting and imaging, Biomaterials, 32 (2011) 7127-7138.

[5] 邹肇娥，王化远，唐元清． 荧光探针的应用［J］． 华西药学杂志，1991，6( 4) : 223 － 228．

[6] J. Yang, F. Zeng, X. Li, C. Ran, Y. Xu, Y. Li, Highly specific detection of Abeta oligomers in early Alzheimers disease by a near-infrared fluorescent probe with a 'V-shaped' spatial conformation, Chem Commun (Camb), 56 (2020) 583-586.

[7] A.G. Kreutzer, S. Yoo, R.K. Spencer, J.S. Nowick, Stabilization, Assembly, and Toxicity of Trimers Derived from Abeta, J Am Chem Soc, 139 (2017) 966-975.