校园环境中产芽孢细菌的分离及活性研究文献综述

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

一．研究目的

产芽孢细菌广泛地分布于土壤、空气、水体、动物肠道之中，通过产生芽孢的方式抵御紫外线、电磁辐射、热、化学物质对菌体产生的侵害，获得良好的抗逆性。产芽孢细菌能够分泌淀粉酶、纤维素酶等多种可用于工业生产的酶类物质。在医学上，芽孢杆菌因为其抑菌抗菌性被制成用于平衡菌群的活菌制剂。产芽孢细菌还能直接或间接的方式对杀伤藻类细胞，为生物防治赤潮、水华提供了新的思路。本实验拟从自然界中分离有活性的产芽孢细菌，为其开发应用打下基础。

本实验拟从校园中分离纯化产芽孢细菌，研究分离出的菌株的产酶、抑菌、溶藻活性，并对活性高的菌株进行菌种鉴定。

二．研究方法

1. 样本的采集
   1. 从校园内随机选择采集点，采集5~8cm深处的土壤样本，记录采集地点、时间、天气、植被状况。
   2. 选择水华较多的水域，采集适量水体。
2. 样本的处理
   1. 将取得的土壤样本放入带有玻璃珠的三角瓶中，加入无菌蒸馏水，摇床震荡至土壤均匀分散
   2. 将三角瓶80℃水浴加热30min，冷却后10^-1~10^-4梯度稀释，取各浓度的菌液在固体培养基上涂抹均匀，恒温培养
   3. 将取得的水体样本放入三角瓶中80℃水浴加热30min，冷却后10^-1~10^-4梯度稀释，取各浓度的菌液在固体培养基上涂抹均匀，恒温培养
3. 芽孢杆菌的分离纯化
   1. 选择菌落较多的平板，观察菌落特征，挑选若干符合芽孢杆菌特征的菌落
   2. 用平板划线法对菌落进行再次纯化，最终得到单菌落
   3. 观察并记录菌落形态，将纯化得到的单菌落接种至斜面保存
4. 芽孢杆菌的菌种鉴定
   1. 从斜面培养基上挑取纯培养物，革兰氏染色，镜检。记录细菌形态
   2. 进行生理生化实验。生理生化实验内容包含过氧化氢酶实验、需氧性实验、酪素水解实验、淀粉水解实验、硝酸盐实验、卵磷脂酶实验、苯丙氨酸脱氨反应、耐盐性实验。
   3. 对照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌手册》确定细菌种类
5. 淀粉酶活性测定
   1. 将菌种接种至淀粉平板培养基上，恒温培养
   2. 用卢戈氏碘液对菌落较多的平板进行染色，记录透明圈直径和菌落直径的比值(D/d)
6. 蛋白酶活性测定
   1. 将菌种接种至脱脂奶粉平板培养基上，恒温培养
   2. 记录透明圈直径和菌落直径的比值(D/d)
7. 抗菌活性测定
   1. 从斜面培养基上挑取菌种接种于发酵培养基上，摇床培养
   2. 收集发酵液离心，取上清液，80摄氏度水浴加热10min消除过氧化氢的影响
   3. 选择合适的指示菌，管碟法测定效价
8. 溶藻活性测定
   1. 供试藻的处理
      1. 以铜绿微囊藻为供试藻种，培养基为BG11，光照强度2000lx、光暗比12h:12h
      2. 恒温培养箱中扩大培养,实验时按所需藻量接种于BG11.
   2. 有溶藻活性的菌株筛选
      1. 用液体培养基对菌种进行活化
      2. 将活化后的菌液适当稀释后接种在一定量的藻液中，每隔一段时间观察并记录藻液的黄化程度
9. 数据处理与实验结果

三．文献综述

1. 芽孢杆菌简介
   1. 芽孢杆菌的结构

芽孢杆菌是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生孢子的杆状细菌。这类细菌多数为腐生菌，主要分布于土壤、植物体表面及水体中，由于它们能够产生对热、紫外线、电磁辐射和某些化学药品有很强抗性的芽孢，因此能忍受多种不良环境。芽孢是某些细菌产生的有较强抗性的休眠体，能帮助细菌抵抗不良环境。自然界中能产芽孢的细菌很多，主要包括经典芽孢杆菌属和从原芽孢杆菌属分出的相关属。菌体形状有球形、杆状和梭状等，呼吸方式有好氧、兼性厌氧和厌氧之分，芽孢所在的位置有的在顶端，有的在中部^[1]。

1. 芽孢杆菌的分布
   1. 土壤中的芽孢杆菌

芽孢杆菌是土壤细菌中最具活力的部分之一，也是土壤细菌的主要类群之一。影响土壤中芽孢杆菌分布的因素很多，土壤颗粒的性质、土壤的水分、氧气、温度和营养状况是重要因素，因此不同生态条件下土壤芽孢杆菌的数量和种类有所不同。数据表明荒地中蜡状芽孢杆菌最占优势，但随着耕作程度的增加，蜡状芽孢杆菌逐渐减少，巨大芽孢杆菌逐渐增多，成为优势种，这种趋势可以作为区分土壤耕作程度的重要标志^[2]。

• 1. 水体中的芽孢杆菌

在淡水水域中的优势菌种主要是些自养细菌，如蓝细菌、硝化细菌、硫杆菌等，芽孢杆菌分布较少。海洋水域由于具有高盐、高渗透压和低温的环境，优势菌种大多数是革兰氏阴性菌，阳性菌分布很少，芽孢杆菌仅在近海区域能够分离到^[3]。水体及底泥中含有较多的芽孢，而不是芽孢杆菌的营养体。

• 1. 空气中的芽孢杆菌

空气中的微生物很难生长和繁殖。首先，大气中缺乏微生物生长需要的营养物质；其次，紫外线会杀死几乎所有的细菌。但在低空中，由于臭氧层的遮挡，云层的水分、漂浮的灰尘颗粒会为微生物的生长提供条件。尤其是工业区的上空，有机物含量较多，微生物的种类和数量也会增多，但真正能够在空气中存活的微生物主要是各种抗性较强的孢子、孢囊和芽孢[1]。1997年，Shaffer和Lighthart等研究了森林、海岸、城市和乡村四个生态系统，其中共发现19属细菌，其中芽孢杆菌占同时不管在哪个环境下，芽孢杆菌都是空气中的优势菌属^[4]。