星形胶质细胞特异表达的AAV病毒载体的构建文献综述

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

一、课题背景

星形胶质细胞是哺乳动物脑内分布最广泛的一类细胞，也是胶质细胞中体积最大的一种，用经典的金属浸镀技术(银染色)显示此类胶质细胞呈星形，从胞体发出许多长而分支的突起，伸展充填在神经细胞的胞体及其突起之间，起支持和分隔神经细胞，为神经元提供营养的作用。由于实验的需要，我们常常要求目的基因只在此细胞特异表达。基因的特异性表达主要依靠特异性的启动子，这就需要构建载体作为工具，一般广泛用于对精神疾病的研究。GFAP是胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein)的英文简称，原来的实验中是常用对GFAP基因进行PCR，扩增出其启动子片段，经酶切后产生黏性末端，利用其启动子与AAV病毒的AAV-2A环连接，AAV病毒除了主环还需要两个辅助环（AAV2/5,AAVDelta;F6），经过转化小提大提产生质粒，再转染293T细胞，产生病毒，对病毒纯化后，然后将病毒导入星形胶质细胞，判断载体构建成功后，这样就能特异表达出我们所需要的目的基因。现发现利用GFAP基因的启动子构建的载体导入后，其目的基因在神经元和星形胶质细胞中都有表达活性，这样不利于进行后续研究，这就说明启动子的特异性还不够好，要对其进行优化。

二、要解决的问题

文献查明，有人已经将GFAP启动子进行优化，优化后将原来2.2kb长的GFAP启动子改变成693bp的gfaABC1D promoter。经优化后的启动子特异性增强，活性也会增强。本课题研究内容是根据优化后的启动子序列在体外合成启动子，利用优化后的启动子和AAV-2A连接，构建AAV病毒载体，载体成功构建后，其能在星形胶质细胞中特异表达目的基因，载体从而作为一种工具而应用到基础研究中。AAV构建成功后，利用滴度检测与活性检测的方法检测其荧光蛋白基因在细胞中特异性表达的情况，从而可以检测优化后启动子的特异性。希望构建的特异性AAV病毒载体能够对神经科学的进一步研究有所帮助。

三、实验流程

引物设计→PCR扩增→目的基因和AAV-2A环酶切→纯化后连接→转化小提后测序→载体质粒的大提（AAV-2A，AAV2/5,AAVDelta;F6）→293T细胞的传代→三种质粒转染293T细胞→收病毒以及病毒的纯化→转染细胞判断病毒载体是否构建成功→病毒载体特异性的检测

四、研究方法和内容

1. 查找文献解析启动子，明确序列，体外合成启动子

已通过文献查明已经优化的启动子，在addgene质粒库中找到（plasmid#53131）,在序列首段与末端加入酶切位点，送公司序列合成。