新型免疫原性纳米粒诱导肿瘤铁凋亡和改善免疫微环境治疗结直肠癌的研究文献综述

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

研究背景：结肠癌与直肠癌是发生于结肠或直肠粘膜上皮的恶性肿瘤，由于二者发病机理、诊治原则相似，医学上往往将其合并统称结直肠癌（Colorectal cancer, CRC）^[1]。据《2018年全球癌症统计数据》报道，近年来，结直肠癌发病率和死亡率在世界范围内呈现上升趋势，全球范围内其发病率居恶性肿瘤第3位，死亡率居恶性肿瘤第4位^[2]。我国结直肠癌发病率也呈逐年上升趋势，并且预计我国结直肠癌的发病和死亡率还将继续上升，成为最重要的恶性肿瘤。结直肠癌发生具有隐匿性，患者在出现典型临床表现后，往往进入中晚期，一般中晚期患者出现体重减轻、贫血、乏力、便血等症状才被确诊，存在潜在转移风险，失去最佳治疗机会，降低了患者的存活率，5年生存率大约为10 %～20 %^[3]。目前，CRC最有效的根治方法仍是外科手术，而通过联合化疗等综合治疗手段提高手术切除率、减少术后复发、延长生存时间是CRC治疗的重要方向^[4]。CRC的化疗策略主要包括奥沙利铂为基础的FOLFOX（5-氟尿嘧啶/甲酰四氢叶酸/奥沙利铂）一线化疗方案，部分研究表明，患者能在FOLFOX化疗中获益^[5]。此外，联合伊立替康组成的FOLFIRI（5-氟尿嘧啶/甲酰四氢叶酸/伊立替康）方案也是临床常用化疗方案，尽管这些化疗方案可延长晚期结肠癌患者的生存期，但中位生存期仍不足两年，且此类化疗药物全身毒副反应大，患者耐受性差，生活质量也较差^[6]。因此需要开发治疗结直肠癌的新型药物和更多疗法。作为肿瘤治疗的热点之一，免疫治疗近年来已成为CRC治疗的新兴策略之一，并得到了国际上极高的关注^[7-10]。目前已批准临床应用的免疫检查点抑制剂包括细胞毒T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4）、抗体伊匹单抗（ipilimumab）、程序性死亡受体1（programmed cell death protein-1，PD-1）抗体pembrolizumab以及程序性死亡受体1配体（programmed cell death protein-1 ligand，PD-L1）的抗体atezolizumab。这些免疫检查点抑制剂已在临床上表现出对很多肿瘤有效，但是对CRC的效果有限，但联合化疗策略时，治疗效果有所改善^[11]。因此，提高肿瘤免疫原性和诱导CD⁸ T细胞的浸润对于增强肿瘤免疫治疗是有益的。此外，大多数化疗方案被认为是免疫沉默的，甚至是免疫抑制状态。但是，最近有研究表明有些化疗药物具有促炎和能引起免疫原性细胞死亡（ICD）作用，ICD不同于正常的细胞凋亡，它是通过激活DC细胞进而激活特定T细胞响应而诱导的免疫反应^[12]。ICD伴随着一系列肿瘤细胞表面成分的改变，以及肿瘤细胞释放可溶性介质。例如，钙网蛋白（CRT）外翻，释放大量的三磷酸腺苷（ATP）和高迁移率族蛋白B1（HMGB1）到细胞外，这些都有利于招募大量DCs并呈递给T细胞，从而激活免疫反应^[13]。因此可使用化疗药物诱导ICD并联合免疫检查点抑制剂用于抗肿瘤免疫治疗,增强CRC的治疗效果。

拟解决的问题：结直肠癌的发生是多因素、多阶段、多基因相互作用的结果，因此依靠化学药物联合治疗或分子靶向治疗，效果仍可能有限。此外，铂类抗肿瘤药物的临床应用面临包括严重剂量限制性毒性(尤其是肾毒性和神经毒性)、体内与血浆蛋白络合而迅速失活以及耐药性等主要问题。因此，我们将制备奥沙利铂-铁配位前药包裹铁凋亡诱发剂BSO自组装成纳米颗粒，并将其包裹在PEG修饰的脂质体内，达到减少药物渗漏和缓慢释放的目的，降低不良反应的发生率。同时联合使用免疫检查点抑制剂PD-L1，实现化疗、化学动力学疗法和免疫疗法的有机结合，有望显著改善结直肠癌患者的预后。

研究内容和研究手段：首先，需要合成四价铂与铁离子配位的化合物前药，并对其进行纯化。纯化后的产物可通过质谱、核磁共振氢谱、核磁共振碳谱以及高效液相法进行结构的表征及纯度鉴定。随后，将四价铂-铁离子配位化合物与BSO共孵育使其自组装形成纳米粒，并对纳米粒的外观、粒径和表面电荷进行表征，再将纯化的纳米粒通过薄膜分散法包裹在磷脂材料的中，制备具有核-壳结构纳米铂化疗/免疫联合治疗脂质体纳米粒（BSO-Pt(IV)/Fe@LNPs-PEG）。对于制备的脂质体，我们将进行一系列性质的表征和考察，包括通过透射电镜（TEM）对脂质体纳米粒的外观进行观察；通过紫外和高效液相测定脂质体的包封率和载药量（离心法或透析法）；通过在不同介质（PBS、含20 % FBS的PBS、5 %葡萄糖溶液、去离子水等）中保存时脂质体和纳米粒的粒径随时间变化评价其循环稳定性；在不同pH和不同GSH浓度条件下评价脂质体中的药物释放的情况。体外细胞实验分别比较脂质体、裸露的纳米粒及游离的四价铂-铁配合物对结直肠癌细胞的杀伤作用。MTT实验评估脂质体等对于结直肠癌细胞株的细胞毒性；Calcein-AM/PI染色后荧光显微镜观察脂质体等对于结直肠癌细胞的杀伤能力；通过Annexin V/PI染色考察脂质体等诱导细胞凋亡的情况；通过激光共聚焦显微镜（CLSM）观察脂质体等诱导结直肠癌细胞的钙网蛋白外翻情况，并用流式细胞仪进行定量；通过ICP-MS测定细胞在不同时间点对脂质体的摄取情况。

研究创新性和意义：首次将铁凋亡、化疗药物奥沙利铂和GSH生成抑制剂BSO通过自组装整合到一个纳米系统中，并且辅以PEG修饰的磷脂双分子层包裹，将明显减少铂类药物的副作用，同时放大奥沙利铂诱导ICD的能力，增强体内外抗肿瘤疗效。同时联合免疫检查点抑制剂PD-L1治疗有望克服临床CRC化疗策略的不足之处，延长CRC患者的存活期，改善预后。

主要成果形式：中国药科大学本科生毕业论文

工作计划：

4.15-4.25 四价铂-铁配位化合物的合成、纯化以及性质表征

4.26-5.10 制备四价铂纳米粒和脂质体并进行处方筛选优化

5.11-5.25 四价铂脂质体性质表征及抗肿瘤活性评价