三羧酸循环中间体及相关氨基酸的靶向分析方法建立文献综述

一、研究背景

三羧酸循环（Tricarboxylic acid cycle, TCA），也被称之为柠檬酸循环，是需氧生物体内普遍存在的代谢途径。英国生物学家克雷布斯发现了这个代谢通路，所以又称之为克雷布斯循环（Krebs Cycle）。三羧酸循环是细胞能量代谢和化学合成的核心，是糖、脂肪、蛋白质（氨基酸）彻底氧化、放出能量的共同途径。机体内的新陈代谢是一个统一的循环过程，同一细胞内各种代谢过程均有规律的进行，他们之间共同的中间代谢产物，如丙酮酸、乙酰辅酶A、草酰乙酸及alpha;-酮戊二酸等相互沟通，因此TCA也是三大营养物质代谢互相联系和转化的枢纽^[1-3]。氨基酸主要通过脱氨基和转氨基反应进入TCA循环，其中甘氨酸（glycine, Gly）、丙氨酸（alanine, Ala）、丝氨酸（serine, Ser）、缬氨酸（valine, Val）、门冬酰胺（asparagine, Asn）、门冬氨酸（aspartic acid, Asp）、谷氨酰胺（glutamine, Gln）、谷氨酸（glutamic acid, Glu）、精氨酸（arginine, Arg）、半胱氨酸（cysteine, Cys）、甲硫氨酸（methionine, Met）、脯氨酸（proline, Pro）、组氨酸（histidine, His）为生糖氨基酸，能够生成丙酮酸、alpha;-酮戊二酸、琥珀酸或草酰乙酸等进入TCA循环。亮氨酸（leucine, Leu）、赖氨酸（lysine, Lys）为生酮氨基酸，能够生成乙酰辅酶A或乙酸进入TCA循环。还有一些氨基酸为生糖兼生酮氨基酸，包括苏氨酸（threonine, Thr）、异亮氨酸（isoleucine, Ile）、苯丙氨酸（phenylalanine, Phe）、酪氨酸（tyrosine, Tyr）及色氨酸（tryptophan, Trp）。以上氨基酸进入TCA循环后，通过代谢产生能量^[4]。

已有研究表明，在多疾病中都存在三羧酸循环代谢紊乱的现象，提示我们三羧酸循环代谢紊乱可能与某些疾病相关。俞晓忆等研究表明用棕榈酸诱导引起细胞中三羧酸循环代谢异常变化可能与糖尿病肾病有关^[5]；张征等研究表明热应激抑制三羧酸循环相关酶的活性，从而导致该循环的中间产物，如琥珀酸、延胡索酸和苹果酸等代谢物不能充分代谢而造成水平显著升高，提示了线粒体的损伤和三羧酸循环的异常^[6]；徐婷婷等利用GC/MS分析大鼠给与商陆后尿液代谢产物变化，发现其尿中alpha;-酮戊二酸、柠檬酸、苹果酸等显著上升，而异亮氨酸、肌酐、甘氨酸等则显著降低，由此表明商陆的肾损伤机制可能是通过影响三羧酸循环、氨基酸代谢等通路，进而引起氧化应激及细胞凋亡的发生^[7]；杨巧珍等研究表明琥珀酸在口腔扁平苔藓炎癌转化过程中组织和细胞水平均存在改变的代谢物，可作为口腔扁平苔藓炎癌转化进一步机制研究的关键代谢物^[8]；代谢改变是肿瘤的十大特征之一进而影响肿瘤的发生和进展，TCA循环代谢产生的能量为肿瘤的繁殖及生长提供所需，与肿瘤的生长相关^[4]。大量文献报道，肿瘤患者体内氨基酸含量与正常人相比存在差异，氨基酸在机体新陈代谢起着重要作用，随着肿瘤细胞代谢而改变的氨基酸，可能涉及原发肿瘤的形成、生长和浸润转移等情况^{[4, 9-11]}，因此研究肿瘤患者内源性氨基酸代谢谱变换对于肿瘤的诊断有重要的临床价值和现实意义。

气相色谱法分离氨基酸具有分离时间短、柱效高、容易和质谱仪联用等优点。气质联用相对于简单的气相色谱法可以明显提高对样品的检测限和灵敏度。氨基酸含有羧基、羟基等极性基团。需要先将氨基酸衍生为易气化的物质，利用气态式样中各组分在两相间的分配系数不同进行分析^[12-13]。张红漫等将氨基酸水解后进行羟基酯化和氨基酰化的衍生反应，利用GC/MS测定了中药沙苑子中包括甘氨酸、丝氨酸、亮氨酸在内的15个氨基酸^[14]；张春兵等用三甲基硅烷化试剂将氨基酸衍生，利用GC/MS测定了脑组织和血清中缬氨酸、亮氨酸、丝氨酸、甘氨酸等多种氨基酸^[15]；张征等用N, o-(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)将样品进行衍生化，利用GC/TOFMS对琥珀酸、延胡索酸等三羧酸循环代谢中间体和缬氨酸、亮氨酸、天冬氨酸等氨基酸进行了测定^[6]；彭素芳等以甲基三甲基甲硅烷基三氟乙酰胺（MSTFA）［1%三甲基氯硅烷（TMCS）］为衍生化试剂，采用液质联用，测定了人体血清中精氨酸、丙氨酸、天冬氨酸等多种氨基酸^[16]；吴胜明等应用硅烷化试剂N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺和双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺将样品衍生化，用GC/TOF-MS对小鼠血清中氨基酸等内源性代谢物进行测定^[17]。

本研究拟建立三羧酸循环中间体及相关氨基酸的GC/MS靶向分析方法，GC/MS集气相色谱法的高分离效能与质谱法的高选择性、高灵敏度及丰富的结构信息于一体，可对三羧酸循环中间体及相关氨基酸进行有效分离和灵敏检测，该靶向分析方法的建立为将来关于TCA循环代谢相关疾病的机制研究或诊断等提供参考。

二、研究方法

1、分析方法的建立

参考文献方法，摸索优化色谱质谱条件，实现TCA循环物质的有效分离和检测灵敏检测。

2、完成方法学验证