NosI的原核构建、表达、纯化及活性鉴定文献综述

NosI的原核构建、表达、纯化及活性鉴定一、研究背景硫肽类抗生素为一类具有多个噻唑环结构及脱水氨基酸残基的大环肽类微生物次级代谢产物，其结构多样，生物合成途径表现为典型的核糖体合成翻译后修饰（ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides，RiPPs）特征。

归属于e系列的诺西肽（Nosiheptide）主要由一个大环骨架以及侧环吲哚系统组成，后者的生物合成及连接过程涉及多个酶促反应，其中NosI为一种腺苷酸化蛋白，负责3-甲基吲哚酸（3-methylindolic acid，MIA）的活化并将活化产物连接到载体蛋白NosJ的磷酸泛酰巯基乙胺手臂（phosphopantetheine，Ppant），但其连接机制尚不清楚。

研究诺西肽侧环吲哚系统连接反应过程中的酶，建立相关的分离、纯化及活性鉴定方法，将有助于诺西肽的生物合成途径阐释和指导NosI酶促反应特性研究。

本课题拟建立NosI的原核构建、表达、纯化及活性鉴定方法。

二、拟研究的问题1、nosI基因的原核构建与测序分析2、对表达体系中最适温度、最适时间以及最佳IPTG浓度进行摸索，建立最佳表达条件并表达NosI蛋白3、采用亲和层析技术分离纯化目的蛋白，BCA法测定其浓度4、基于酶促反应原理建立NosI酶活测定方法5、学习无菌操作技术、菌种发酵培养、蛋白分离纯化流程三、实验技术路线四、实验方法、手段1、nosI载体构建与测序采用试剂盒法于活跃链霉菌ATCC 25421中提取基因组，PCR法扩增目的片段，再通过基因工程手段制备含nosI基因的重组子，化学转化将其导入感受态细胞DH5alpha;，经单克隆培养以及质粒提取，对重组质粒进行酶切、电泳分析。

采用测序方法对目的基因进行测序分析。

将含nosI的重组子以化学转化的方式导入原核蛋白表达细胞BL21（DE3），最后提取质粒，进行酶切电泳鉴定重组质粒。

2、NosI蛋白表达、条件优化及产物验证在适宜条件下培养含nosI重组子的大肠杆菌，包括种子液制备以及发酵培养。

IPTG诱导蛋白表达，离心收集菌体，再进行菌体的超声破壁，释放蛋白内容物。