紫参中醌类和萜类生物合成基因的发现文献综述

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

研究解决的问题：

一、拟研究问题

在前期紫参转录组测序数据的基础之上，通过生物信息学的分析方法预测紫参醌类生物合成途径的关键酶基因，然后分析并验证这些关键酶基因哪些是在醌类生物合成途径中更为关键的基因。

二、研究手段

1. 对所获得的Unigene进行KEGG代谢通路分析，发现一个富集通路（ko00130），共有113条Unigene映射到醌类生物合成途径上。
2. 再通过根和茎叶显著差异表达分析，最后共获得了23个具有显著差异的Unigene，表明这些基因极有可能为紫参蒽醌类生物合成的关键基因。
3. 对所挖掘的关键酶基因一一进行荧光定量PCR(RT-qPCR)引物设计，并验证设计引物的特异性和扩增效率。
4. 提取紫参根或茎叶RNA，反转录cDNA，以cDNA为模板和验证为可用的引物对所挖掘的关键酶基因进行定量分析。
5. 对紫参发状根进行茉莉酸甲酯（MeJA）诱导分别处理1h、6h、12h和24h，然后对诱导后的发根进行各关键酶基因的定量分析。
6. 将相同处理的样本进行LC-MS分析，观察紫参中主要蒽醌类化合物的含量变化，以进一步分析所预测的关键酶基因参与蒽醌生物合成途径之间的联系。

三、文献综述

紫参（Rubia yunnanensis，Diels）为我国云南特有药材，始载于《滇南本草》别名有滇紫参(植物名实图考)、云南茜草(云南中草药)、红根、小活血、色子片(普米族药名)等。紫参为茜草科茜草属植物，其药用部位根及根茎被称为“小红参”。作为云南特有药材，小红参在云南已有数百年的使用历史，其药性甘、温，具有调养气血、活血舒筋之功效，主要用于治疗头晕、肺痨咳血、风湿疼痛、跌打损伤、月经不调、经闭、带下、产后关节痛等。小红参的生物活性主要有抗癌作用、细胞毒性、对T淋巴细胞的作用以及抑制NO的产生。

小红参中主要成分有三类，蒽醌、乔木萜烷型三萜和环己肽类，三者均有文献报道其存在潜在的抗肿瘤活性^[1]。现代药理实验表明，其主要的抗肿瘤活性成分为蒽醌类（小红参醌）化合物、RAs类化合物和三萜类化合物。其中有试验证明，小红参提取物中小红参醌也具有非常强的抗癌活性^[2]，吴政德等^[3]通过实验研究经小红参醌处理的体外培养的P388细胞，发现细胞毒的时相特异性特别明显，在G2M的细胞最为敏感，S细胞居中，G2中的细胞相对敏感性最低；黎文亮等^[4]研究发现小红参醌也可以抑制癌细胞(HeLa、AGZY-83a、MGC-803、HL60)生长，但也能抑制正常人血T淋巴细胞的DNA合成和细胞分裂增殖，表明小红参醌对癌细胞抑制是非特异性的；醌类化合物也往往因为具有DNA拓扑异构酶的抑制活性而具有抗癌活性，如醌类化合物6-Hydroxyrubiadin，对拓扑异构酶I或（和）II就具有抑制活性^[5]；对A549，SK-OV-3，HepG2和HT-29细胞株具有细胞毒活性^[6]，蒽醌类化合物还可以有效地抑制肝再生磷酸酶-3（PRL-3）的表达，进而抑制了肿瘤细胞的迁移；Zeng等^[7]也通过研究发现化合物6-Hydroxyrubiadin对人宫颈癌Hela细胞具有诱导其凋亡以及阻滞其G2/M期等作用。此外，小红参中提取物小红参醌也有较强的抗氧化作用^[8]，还可以提高小鼠耐缺氧能力^[9]，在治疗银屑病方面，早已经取得了较好的疗效^[10-13]。

因此，小红参具有较高的经济价值和广阔的应用开发前景，这也导致了市场上对其需求也日益增多。但是，由于野生紫参植物资源日益濒危，人工栽培尚未规模化等原因，导致紫参不能被广泛地开采与利用，不能够很好地满足市场的需求。谭宁华教授团队前期已经对紫参进行了野外资源调查与鉴定分析、引种栽培和组织培养、化学成分提取与分离及结构解析和修饰、生物学活性分析与作用机制研究及其新药研发等方面进行了系统的研究。但从分子生物学角度上来研究紫参蒽醌类化合物的生物合成途径尚未开展，至今也未有报道。

前期所在课题组通过高通量测序技术—De novo测序（De novo测序可以不需要任何基因序列信息即可对某个物种进行测序。用生物信息学的分析方法对序列进行拼接、组装，从而获得该物种的基因组序列图谱。广泛应用于从头解析未知物种的基因组序列、基因组成、进化特点等），获得小红参茎叶和根的转录组数据。然后根据糖基转移酶基因的保守序列，对目的植物的基因组序列或EST、cDNA 序列进行BLAST比对，再对注释的基因信息进行KEGG代谢通路分析，发现一个富集通路（ko00130），共有113条Unigene映射到醌类生物合成途径上。再通过根和茎叶显著差异表达分析，最后共获得了23个具有显著差异的Unigene，表明这些基因极有可能为紫参蒽醌类生物合成的关键基因。对植物体内的关键酶进行研究分析，传统手段包括分子生物学、生物化学以及遗传学。随着RNA测序技术的发展，转录组测序和全基因组分析等高通量测序技术已经被广泛的应用余植物次生代谢产物的生物合成途径关键酶基因的挖掘。例如，彭亮等^[14]利用转录组测序的方法对茜草转录组测序，并对蒽醌类化合物合成相关基因的进行分析，为后续开展茜草的蒽醌类成分生物合成分子机制和途径解析提供依据。