细胞培养工艺对糖基化蛋白药物中的Mannose 5影响的研究文献综述

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

一、研究背景

当前在生物制药领域，蛋白类药物生产应用广泛，具有较高的临床价值和商业价值,其中单克隆抗体、Fc融合蛋白、重组疫苗等蛋白药物都属于糖基化蛋白药物，其功能的实现与蛋白质糖基化修饰情况密切相关。

糖基化蛋白药物可通过多种宿主细胞表达系统生产，其中哺乳细胞表达系统具有天然的蛋白加工机制，能准确完成蛋白质翻译后修饰如折叠、二硫键形成和糖基化修饰^[1]。中国仓鼠卵巢细（Chinese hamster ovarycells, CHO细胞）从中国仓鼠的卵巢中获得，目前被广泛地应用于实验室研究和工业化生产糖蛋白药物。相比于其他哺乳动物细胞，CHO细胞能高效扩增和表达重组基因，能准确进行转录后修饰，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子。同时，CHO细胞因其抗剪切力强，容易扩大培养，普遍用于生产糖蛋白药物，工业生产技术相对成熟^[2]。随着市场对疫苗和抗体类药物的需求量持续增加，细胞培养技术越来越受到生物医药行业的广泛关注。

蛋白类药物在生产过程中由于受到复杂培养环境的影响，诸如酶解反应或者自发性降解都会造成抗体的异质性，而这种异质性必须通过质量研究进行衡量，以保证产品的完整性和生产过程的一致性。抗体的异质性主要体现在翻译后修饰和降解，主要包括糖基化、C 末端降解、天冬酰胺脱氨基、天冬氨酸异构化、甲硫氨酸氧化等。其中，蛋白质糖基化修饰就是在酶催化下特异糖链在内质网中连接到肽链上的特定糖基化位点形成寡糖链，并在内质网和高尔基体内进一步修饰糖链的过程。蛋白质糖基化根据糖链与蛋白连接形可分为两种，一种是由寡糖连接到天冬酰胺的侧链(N-连接)，一种是寡糖连接到丝氨酸/苏氨酸(O-连接)。已上市抗体类药物的糖链结构基本属于Fc段的N-糖基化修饰。图1简介了哺乳动物细胞生产的蛋白产物糖基化过程：哺乳细胞生产蛋白药物过程中，通常会产生较低水平（一般低于5%）的高甘露糖(Mannose,Man)糖型（包括五聚甘露糖至九聚甘露糖，简称Man5-9）, 这些聚糖进一步变成复杂的糖型：G0F, G1F和 G2F ^[3]。糖蛋白通过内质网（ER），高甘露糖寡糖的还原端被多种酶修饰，其中包括甘露糖苷酶（mannosidase-1）修饰而形成Man5。Man5在高尔基体中进一步加工，包括alpha;-1,3-甘露糖（a-1,3-mannose）的加入和N-乙酰氨基葡糖（Nacetylglucosamine,GlcNAc）的加入而组成混合糖。混合糖又进一步加工成复杂的多聚糖，完成程度不同而形成各种复杂的多糖（G0F，G1F，和G2F），以及少量的高甘露聚糖^[4-5]。

（图上传不成功，见附件）

图1 N-连接糖基化过程

(ER:内质网；Golgi:高尔基体；oligomannos:寡甘露聚糖；hybrid glycan:混合糖；complex glycan:复杂糖；Man9:九聚甘露糖；Man5:五聚甘露糖；mannosidase:甘露糖苷酶；GlcNAC: N-乙酰葡萄糖胺；Fuc:海藻糖；Gal:半乳糖)

药物蛋白不同的糖基化水平会影响其结构和构象，进而影响其免疫性、药效以及药代动力学特性。蛋白质有多种糖基化方式，其中高甘露糖型尤其是高水平的五聚甘露糖（Mannose 5，Man 5)对药物的生物学功能具有显著负影响，可能影响糖基化蛋白药物的清除率、免疫原性、生物活性、稳定性等，从而影响蛋白药物的工业化生产。2000年，Wright^[6]等在小鼠实验中发现由糖基化变异的CHO细胞系Lec 1生产的含有Man 5 糖型的抗体表现出活化能力下降、对FcgRI的亲和力下降以及体外半衰期减短现象。因此，如何有效降低Man5水平一直备受工业界关注。