焦磷酸测序用于粪便DNA中结直肠癌相关甲基化标志物定量检测方法的建立文献综述

课题背景及意义

结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一。近年来，随着人民生活水平的不断提高，饮食习惯和饮食结构的改变以及人口老龄化，我国结直肠癌的发病率和死亡率均保持上升趋势。早期结直肠癌的5年生存率80％以上，中期结直肠癌的5年生存率70％，而晚期结直肠癌5年生存率只有少于50％。大多数患者发现时已属于中晚期。因此，早期大肠癌的检测具有非常重大的意义。

DNA甲基化是调控基因表达的表观遗传机制之一。DNA甲基化状态的改变被认为是引起癌症的一个重要因素，这种变化包括基因组整体甲基化水平的降低和CpG岛局部甲基化水平的升高，从而导致基因组的不稳定和抑癌基因不表达。甲基化分析是认识生理、病理条件下基因表达变化的重要途径。

有研究报道，人粪便DNA中VIM、BMP3、NDRG4等基因甲基化水平可作为大肠癌早期诊断的标志物^[1][2]。目前基于焦磷酸测序的测序方法是DNA甲基化验证分析中的金标准。

焦磷酸测序技术作为一种序列分析技术，精确度很高。焦磷酸测序由4种酶催化同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就能将其加入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸(PPi)。PPi可最终转化为可见光信号，经检测转化为一个峰值，其高度与核苷酸数目成正比。将经重硫酸盐处理的DNA片段进行焦磷酸测序，可以看作是C-T型的SNP改变，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态并快速计算甲基化频率。

本课题拟以大肠癌患者粪便中人DNA为研究对象，经DNA纯化、重硫酸盐转化和PCR扩增后，利用实验室已有的焦磷酸测序技术平台，建立VIM、BMP3和NDRG4基因甲基化定量检测的方法，为大肠癌的早期筛查奠定基础。

课题拟研究问题

　　基于焦磷酸测序技术，建立VIM、BMP3和NDRG4基因甲基化水平定量检测方法，为大肠癌的早期筛查奠定基础。

主要技术手段

1.粪便DNA提取