基于核酸侵入纳米金可视化技术的HPV病毒分型方法研究文献综述

开题报告内容：

一、课题研究背景

人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus，HPV）是一种亲上皮细胞的双链DNA病毒，具有高度的组织特异性和宿主特异性。目前已发现的HPV基因分型超过100种，有40多种型与生殖道感染有关，其中多种型与宫颈癌相关。据2012年研究数据显示，全球女性HPV病毒的感染率为32.1%，HPV感染率在发展中国家为42.2%，高于发达国家的22.6%。每年约有290，000人死于宫颈癌，同时，每年有490，000例新发宫颈癌病例。因此，对HPV病毒发展有效的检测方法具有重要的临床意义和社会价值。现有的HPV病毒检测方法主要为宫颈细胞学检查和杂交捕获等分子生物学技术，但存在操作成本高，步骤繁琐等不足，且灵敏度和特异性都不高。 目前，根据HPV病毒诱发宫颈癌的相关程度，其多种病毒亚型被人为地分成了高危型（High-risk）和低危型（Low-risk）。本课题将主要针对常见的18种高危型HPV，包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82和83等，和6种低危型HPV，包括HPV6、11、41、43和81，共23种HPV病毒亚型，利用纳米金可视化检测技术对HPV病毒进行分型研究，最终实现高灵敏、高特异及可视化的分型检测。

二、目前常用的HPV病毒亚型检测方法

1.细胞学检测技术

近年来，一种现代化的宫颈细胞学涂片技术，即液基薄层细胞学检查（英文简称TCT）越来越广泛的应用于宫颈细胞学筛查中。TCT检查采用液基薄层细胞检测系统检测宫颈细胞并进行国际通行的TBS细胞学分类诊断，是目前国际上最先进的一种宫颈癌细胞学检查技术，与传统的宫颈刮片巴氏涂片检查相比，明显提高了标本的满意度及宫颈异常细胞检出率，TCT检查对宫颈癌细胞的检出率接近100%，同时还能发现癌前病变，微生物感染如霉菌、滴虫、衣原体等。目前在欧美和我国的大中城市，TCT技术已经被应用于妇女宫颈癌的筛查。目前国内有两种进口设备：（1）薄层细胞学检测系统（Thinprep cytologic test，TCT）：1996年获美国FDA批准用于临床。主要方法是将宫颈脱落细胞洗入放有细胞保存液的小瓶中，刮片毛刷在小瓶内搅拌数十钞钟，再通过高精密度过滤膜过滤后，将标本中的杂质分离，取滤后的上皮细胞制成直径为20mm薄层细胞于载玻片上，95%酒精固定，经巴氏染色、封片，由细胞学专家肉眼在显微镜下阅片，按TBS法作出诊断报告。此法对异常细胞诊断率提高了13%，对低度鳞状上皮以上病变的检出率提高了６５％，但该设备一次只能处理一份标本。（2）自动细胞学检测系统（autocyto prep cytologic test），又称液基细胞学检测系统（Liquid-based cytologic test, LCT)：1999年获美国FDA批准用于临床。基本方法是将收集的细胞保存液，通过比重液离心后，经自然沉淀法将标本中的黏液、血液和炎性细胞分离，收集余下的上皮细胞制成直径为13mm超薄层细胞于载玻片上。每次可以同时处理４８份标本，并在全自动制片过程中同时完成细胞染色，达到更高质量及更高效率。这种技术将阅片范围缩小到直径13mm内（而前者为384mm2传统涂片面积为1375mm2），同时阅片最低时间减少到2.5分钟（前者需5.5分钟，传统法则需７分钟），这样可使细胞学专家更容易观察每个视野，从而明显降低假阴性率。

2.分子生物学检测技术

PCR因具有快速、灵敏和特异性强的优点得到了广泛的应用（我们采用PCR直接测序法检测宫颈癌组织中HPV-DNA）通过用一次通用引物的PCR扩增反应可以做大范围临床标本的HPV基因筛查（PCR直接测序法使用的可扩增出L1基因片段的引物是位于多态性、特异型序列两侧的保守序列）通过扩增出的L1序列与基因库中相应型别的HPV L1段进行Blast序列比较）可以同时检测到组织中的同源性很差的多种HPV 类型）有利于HPV少见的特殊类型的检测。

PCR直接测序法也可以进行多重PCR扩增，同时分析多个DNA序列，在取材方式相同的情况下实施定量PCR，则可以通过检测PCR的反应动力曲线得知病毒的含量。近年来有学者将PCR方法与BIOANALYZER 芯片分析系统结合，显示在HPV的早期检测和分型中具有重要的应用价值。随着PCR的发展，人们发现由于其灵敏度高，因而假阳性率偏高，原因可能是引物或标本的DNA污染造成的，认真处理所有DNA标本。同时采用尿嘧啶-N-糖基化酶这种方法防止污染可有效地克服这一缺点。

3.计算机辅助检测技术