小鼠原位脑灌流技术用于生物碱跨血脑屏障转运的研究文献综述

原位脑灌流技术用于生物碱跨小鼠血脑屏障研究

研究目的：

中枢神经系统（Central nervous system,CNS）疾病的治疗一直是一个难题，即使是脂溶性较好的药物，也存在脑内分布少，治疗效果不佳的问题。主要原因是构成血脑屏障（Blood-Brain Barrier,BBB）的脑微血管内皮细胞间存在的紧密连接和其管腔侧外排转运体的高度表达。目前人们已发现BBB上存在多种转运蛋白介导多种药物的脑部外排与吸收，包括ATP结合盒（ATP binding cassette,ABC)转运体和溶质转运体（Solute carrier,SLC)家族。因此，阐明BBB上转运体的对药物跨BBB的影响具有重要价值。

已发现的治疗CNS疾病如阿尔茨海默病（AD）的药物有很多是中药单体生物碱类化合物。石杉碱甲、加兰他敏、川穹嗪等均能有效控制AD的发展。另外，基于多组分、多靶点和多用途的整合调节发挥作用的中药复方，在脑部疾病的治疗中也日益引人关注。阐明中药生物碱成分BBB转运的分子机制，将能清晰地揭示其对靶细胞的作用特点。

研究方法：

原位脑灌流技术是研究物质跨血脑屏障( blood-brain barrier, BBB) 转运的一种快速、敏感、定量和可控的方法。它通过直接向通往实验动物如小鼠的颈动脉灌流可以取代体循环血液的灌流液, 待研究物质以已知质量浓度混入灌流液中随其流动在一定时间内运送到脑部, 到达预设时间, 结束灌流, 测定待研究物质的入脑量; 由所测结果分析物质的入脑吸收动力学特征。该操作比离体灌流法简单, 且同时具有活体的真实性, 灌流液中待研究物质质量浓度可控, 便于研究物质跨BBB 转运的动力学特征, 并可阐明中枢神经系统( CNS) 中毒与BBB 功能的关系，促进新药研究与开发。尤其在研究物质跨BBB 转运及机制方面具有广阔的应用前景。

原位脑灌流技术敏感性高, 可完全控制进入脑血管溶液的质量浓度, 可以准确研究诸如 pH值、离子、流速、蛋白质量浓度等因素对物质入脑吸收的影响, 并且能够对局部脑灌流速度直接控制, 另外混入灌流液 的血液干扰很少, 可对脑血管转运进行正确测量。鉴于这些优点, 该技术在研究物质跨BBB转运动力学及其机制方面具有明显的优势, 它可简便地描绘出物质入脑的动力学变化及计算出各动力学参数, 可研究许多物质如金属离子、肽类及蛋白质大分子以及缓慢渗透性物质的跨 BBB 转运机制, 阐明不饱和的被动扩散或者载体介导的竞争性转运的饱和机制, 还可用于研究BBB的性质, 并辅助阐明 CNS 中毒与BBB 功能之间的关系, 促进解决药物在CNS的毒副作用及耐药现象。为此我们选择了脑灌流技术。

实验具体步骤：

1. 配制缓冲液
2. 配制含药缓冲液的灌流液
3. 灌流液通两次灌流管路，使药物在灌流实验过程中损失达到最小。
4. 开始做小鼠颈动脉插管，切断心脏流路之后开始灌流。
5. 完成灌流后直接拔出导管，用tube管接取灌流液，用HPLC监测灌流液浓度。
6. 取出小鼠灌流后灌流侧大脑，用PBS溶液快速洗两遍，然后用纸吸干水分，置于称量过得tube管中，再次称量，计算差值即得大脑重量，于-20℃保存，LC-MS/MS分析之前用三倍的PBS匀浆成脑浆然后用生物样品提取方法处理。

课题研究日程及计划：