表达EGFP LC3B自噬调控药物筛选模型的建立文献综述

一、课题目的：

通过对细胞自噬过程中EGFP-LC3B表达的检测，建立以自噬调控为机制的药物筛选模型，从而筛选出影响肿瘤细胞自噬途径的抗肿瘤药物。

二、课题意义：

自噬在抗肿瘤药物治疗中也起重要作用，提示自噬调控信号通路的某些关键的蛋白可能成为新的药物作用靶点，改善抗恶性肿瘤药的疗效。

三、国内外研究概况：

在生物医学高度发达的今天，越来越多科学家们投身于对自噬的研究，因为其已成为继凋亡之后生物医学最热门的领域之一。除维持生理状态下机体的稳态功能外，自噬通路的障碍可能与肿瘤、感染、神经退行性变等疾病相关[1]，所以，研究者在探讨自噬的现象及其生物学作用时，最初要观察自噬现象，然后监测自噬功能的变化和实验性调控自噬活性。对于药物研发人员而言，研究自噬通路上的各个靶点尤为重要，在筛选有潜在自噬活性药物时不仅要研究细胞内的自噬变化，更要通过一系列实验阐明活性药物的靶点和机制。

自噬体为双层膜包被的圆形或椭圆形结构，多位于细胞核周围，线粒体和粗面内质网附近[2]。在肌动蛋白和肌球蛋白的作用下[3]，自噬前体弯曲，封闭形成自噬体。微管相关蛋白1 轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)是酵母Atg8 的同源体，调控微管蛋白的组装和去组装，参与自噬体形成。LC3 包括LC3-I 和LC3-II 两种存在形式，前者是可溶性的，位于细胞质中；后者在自噬前体和自噬体的内外膜特异表达[4]。在自噬溶酶体内，与溶酶体膜融合的自噬体外膜上的LC3-II 脱离入细胞质，而自噬体内膜上的LC3-II 被溶酶体酶降解[5]。因此，LC3 可作为自噬结构的标志物。人们常采用免疫印迹和免疫沉淀法检测LC3-I 和LC3-II 的表达变化，通过其表达特点评价细胞自噬活动。最新研究发现，LC3 阳性自噬结构中呈泡状的占2/3，其余呈管状或管囊状。管状结构不足10%。管囊状结构在细管末端或中段有囊状膨大。在自噬体成熟过程中，管状结构向囊状结构转变[6]。

在自噬过程中，自噬体内膜上的 LC3-Ⅱ被溶酶体降解，可通过免疫印迹监测自噬过程中 LC3 蛋白量的变化或流式细胞仪监测 EGFP-LC3 荧光强度的变化即可反映自噬活性．在自噬诱导一开始，EGFP-LC3 点状聚集显著增多，随后信号可能会出现下降，代表着自噬性降解的发生．还有其他一些自噬性降解的底物如p62蛋白。最近已经认为可以通过自噬特异性被降解，因此其表达量的变化也可用于监测自噬潮[7]。

自噬调控的信号通路：

1、依赖 mTOR 激酶途径的自噬：mTOR 激酶作为一种丝氨酸／苏氨酸激酶，可在多种因素的活化下参与基因转录、蛋白质翻译起始、核糖体生物合成、细胞凋亡等过程。 mTOR 激酶可能通过直接磷酸化 Atg13， 改变 Atg13 和 Atg1 的结合状态，影响自噬体的形成[8，9]。胰岛素、生长因子通过酪氨酸激酶受体激活 ClassⅠPI3K，使 PIP 被磷酸化为 PIP3， 后者激活 AKT， 活化的 AKT 可以磷酸化TSC2， 增加具有 mTOR 结合活性的 GTP-Rheb，使mTOR 活性增强，抑制自噬[10]。在细胞氧化应激、能量不足时，AMPK 活性增强，使 TSC1/2 复合体激活，也可直接磷酸化 mTORC1 中 raptor 蛋白， 抑制 mTOR活性，从而激活自噬[11]。