SDS-PAGE条件优化及银染方法的建立文献综述

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

一．本课题研究背景与意义

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是一种可靠的分析蛋白质特性技术。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(Acr)和交联剂N，N一亚甲基双丙烯酰胺(Bis)在催化剂过硫酸铵(APS)，N，N，N，N四甲基乙二胺(TEMED)作用下，聚合交联形成的具有网状立体结构的凝胶，以此为支持物进行电泳的技术称为SDS-PAGE。其在分析蛋白质特性方面具有仪器简单，操作简便、重复性好，可靠性强，适用性广等优点，因而成为蛋白质分析和研究中的重要手段，在许多实验室得到广泛的应用。因此，在此基础上对SDS-PAGE分析检测蛋白质的条件优化进行研究，探索出更简捷，经济，效果理想的实验方法，对分子生物学及有关学科的基础和应用研究具有十分重要的意义。

二．本课题国内外研究进展及存在的问题

SDS电泳技术首先在1967年由Shapiro建立 ,1969年由Weber和Osborn进一步完善。他们发现,在凝胶系统和样品液中加人十二烷基硫酸钠(SDS)后,蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小,其它因素可以忽略不计。Laemmli在1970年建立了SDS-PAGE中的不连续凝胶电泳系统，这种不连续的电极缓冲体系使快慢离子之间形成一个移动界面, 它限制了蛋白迁移过程中的扩散，使得电泳带比较清晰。Lanzillo 等发现在Laemmli体系中低分子量多肽常常堆积在浓缩胶中后，1987年由Schagger 等提出了能够分离较大相对分子质量范围内的蛋白质的Tris-tricine体系。但国内一些学者在用Tris-tricine体系分离小分子肽的实验中发现 ,该方法分离大于2kDa的蛋白质效果尚可,但分离小至 1kDa 的小分子时效果并不理想,表现为带型弥散。

蛋白质染色是SDS-PAGE的一个重要的组成部分，传统的考马斯亮蓝染色法虽然操作简单，但分辨率不高。1979年Merril等在组织学的银浸透法的基础上发展了一种新型的电泳染色方法银染法，这是一种高灵敏度、非放射性的蛋白染色方法，主要是通过银离子渗透进入凝胶内与蛋白质结合，再用还原剂将与蛋白质相结合的银离子还原为金属银，从而达到检测蛋白质的目的。根据银染时溶液条件的不同， 蛋白质银染法可分为酸性银染法和碱性银染法即银氨法。酸性银染法比碱性银染法操作相对简单，但灵敏度没有碱性银染法高。虽然在所有染色方法中，银染法的灵敏度是最高的，但其缺点也很明显，如耗时长、步骤繁多、高背景、线性范围小和质谱兼容性差等。

围绕银染法的不足，科研工作者对该方法进行了不断的改进，银染法的质谱兼容性已成为当前研究的热点。银染中醛类还原剂能与蛋白质以共价键结合，使蛋白质甲基化，造成蛋白质下游研究的质谱兼容性降低。Shevchenko等用醇和酸的溶液代替以往醛类对蛋白质进行固定，虽然灵敏度有一定的降低，但蛋白质经银染后的质谱兼容性得到了提高。Jin 等首先采用染料离子如钙红指示剂和铬黑T作为银染增敏剂，以减少显影液里甲醛的用量，使得蛋白质鉴定时质谱兼容性得到大幅提高。Chevallet等发明的用还原糖代替甲醛的银染方法也取得了较好的灵敏度与质谱兼容性。Jin还在前人研究基础上创建了EZ-银染双重染色法，即用阴阳染料离子对完成第一步染料染色，灵敏度为2～8 ng/band，根据实验需要可选择性地进一步进行银染，灵敏度可达0.05～0.2ng/band，为目前最灵敏的蛋白质银染法。由于染料分子中含偶氮键，在银离子还原中可起到增敏的作用，因此降低了甲醛的使用量，增加了银染法的质谱兼容性。此外，针对银染往往容易造成高的背景的缺点，国内学者朱宏等通过试验发现，其中一个重要的原因是配制凝胶的过程中所用的蒸馏水不够纯净。用接触过橡胶管的蒸馏水制备凝胶 ,在银染后发现它的背景远逊于没有接触过橡胶管的蒸馏水制备的凝胶。用硫代硫酸钠处理过的凝胶的背景不如没有用硫代硫酸钠处理过的凝胶的背景。这为实验工作者对于实验试剂的严格规范性提出了新的要求。

三．本课题主要研究内容及研究方法