重组甲基化结合蛋白-链霉亲和素融合蛋白的表达及活性分析文献综述

一、研究背景和目的研究背景：DNA的5-甲基化胞嘧啶（5-methylcytosine, 5-mC）修饰是表观遗传学的重要研究内容。

机体通过DNA的甲基化修饰，调节转录因子结合、组蛋白去乙酰化等过程，最终调控靶标基因的表达水平。

DNA甲基化在机体的生长、发育以及疾病的发生、发展等生理、病理过程中发挥着广泛的作用，几乎所有的人类肿瘤中都存在肿瘤相关基因的异常甲基化。

甲基化胞嘧啶识别域（methyl-CpG binding domain, MBD）是甲基化结合蛋白家族共同的功能结构域，可以特异性地识别DNA中的甲基化胞嘧啶。

通过将甲基化结合蛋白标记上信号报告基团，对细胞进行分析，可以实现对DNA甲基化修饰的检测。

但常规的化学修饰方法容易导致蛋白活性的降低甚至丢失。

研究目的：本课题提出将甲基化胞嘧啶识别域与链霉亲和素进行融合表达，借助链霉亲和素-生物素的相互作用，实现温和条件下对功能蛋白的快速、无损标记。

二、研究方法1.重组工程菌的构建1.1将人MBD结构域序列与SA序列以及连接序列插入质粒载体1.2质粒载体导入工程菌中2. 重组蛋白的表达2.1对大肠杆菌培养2.2进行IPTG诱导表达2.2.1对诱导表达的诱导温度进行优化 2.2.2对诱导表达的诱导时间进行优化2.2.3对诱导表达的诱导时机进行优化2.2.4对诱导表达的诱导剂用量进行优化。

3. 重组蛋白纯化3.1按最优条件培养表达菌体 3.2用镍亲和柱对蛋白进行纯化3.3对纯化条件进行优化4. 重组蛋白的功能验证4.1验证重组蛋白对甲基化DNA的结合性能三、文献综述1、DNA甲基化的意义 DNA甲基化是在不改变DNA序列的情况下进行基因的外部修饰，这是在生命活动中最为普遍的DNA修饰现象，对基因表达发挥重要调控功能。

在DNA甲基转移酶催化下,利用 S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基 ,将胞嘧啶的第5位碳原子甲基化,从而使胞嘧啶转化为 5-甲基胞嘧啶。