融合有逆转录酶结构域的Cas1蛋白异源表达载体的构建、纯化 及其活性研究文献综述

一、课题背景

CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats），被称为成簇的规律间隔短回文重复序列，广泛存在于细菌和古生菌基因组中。在CRISPR位点上游排列着Cas（CRISPR-associated system）基因，其表达的蛋白可协助CRISPR基因的表达、加工、外源基因的选择和剪切。CRISPR-Cas是基于CRISPR的原核生物获得性免疫系统^[1]，某些细菌在遭到病毒或外源质粒入侵后，能够把外源基因的一小段序列存储到自身的DNA序列中，即CRISPR。当再次遇到相同外源序列入侵时，细菌能够根据存写的片段识别出此段序列，将外源DNA切断从而沉默。基于此，科学家们衍生出了CRISPR/Cas9基因编辑技术，经过多种改造和反应条件优化^[2]，其精度正在不断提高，因此作为一种高效工具应用于多个领域进行基因编辑。

CRISPR位点，也被称为CRISPR array，主要由一个前导序列(Leader)、多个短而高度保守的重复序列（Repeat）和多个间隔序列（Spacer）组成，后面二者交叉排列。前导区一般位于CRISPR簇上游，是富含AT长度约为300～500bp的区域，被认为可能是CRISPR簇的启动子序列。重复序列长度大多为21～48bp，含有回文序列。重复序列之间被长度为26～72bp的间隔序列隔开^[3]，主要来源于宿主菌俘获的外源DNA。目前，CRISPR/Cas系统根据Cas基因转录出的蛋白是形成复合物还是单一作用分为两大类（Class1/2），而根据pre-crRNA的处理和干扰机制的不同分为六种类型（typeI-VI）。CRISPR/Cas系统的免疫机制主要包括三个阶段：间隔序列的获取，即适应阶段（Adaptation）：CRISPR基因的表达和加工（Expression）；靶向干扰（Inteference）^{[4, 5]}。

CRISPR的适应阶段需要几个过程，包括前间隔序列（prespacer）的选择和处理、在CRISPR array上的定位和对接以及随后整合到CRISPR位点。这些过程的核心是一种蛋白质复合物，即Cas1/Cas2，多以六聚体（Cas1）₄（Cas2）₂形式存在。对于给定的CRISPR系统，其间隔序列的长度范围以及插入方向都是确定的，换句话说，不同系统的Cas1/Cas2对前间隔序列有选择性。在Cas1/Cas2复合物获得前间隔序列后，Cas1-Cas2-前间隔序列与前导序列和第一个重复序列结合。对于I型和II型系统，此过程需要整合宿主因子（IHF）和前导序列锚定位点(LAS)的识别。第一次亲核攻击最有可能发生在前导序列-重复序列相接处，并连在重复序列上，产生半整合中间体。第二次亲核攻击发生在同一个重复序列与相邻间隔序列之间，连在重复序列的另一条链上，导致全位点整合。最后，宿主DNA修复酶填补重复序列，产生新的间隔序列^[6]。

在Type III型的CRISPR-Cas系统中发现某些 Cas1蛋白与逆转录酶 (reverse transcriptase, RT) 发生了天然的融合，即细菌可能对外源RNA序列进行逆转录而获得新的间隔序列，这将扩大其获得性免疫，且可通过此方式调节自身基因的表达。这种融合的RT-Cas1除了可以从DNA中获取遗传信息外还可以直接从RNA中获取间隔序列。目前，领域内对RT-Cas1的研究还处于起步阶段，现有的生化实验证据仅能证明RT-Cas1能将RNA和DNA进行整合，但对其具体作用机制的研究还非常缺乏^[7]。

二、要解决的问题

通过构建不同的大肠杆菌表达载体，在体外表达纯化多种不同融合有逆转录酶结构域的Cas1蛋白。之后，对纯化得到的高纯度Cas1进行体外整合能力和延伸能力的表征，找出其最是核酸底物和反应条件。最后，比较融合有逆转录酶结构域的Cas1与不含逆转录酶结构域的Cas1蛋白整合能力的差别以期阐明二者在分子进化学上的关系。

三、可行性分析

使用SnapGene软件分别设计RT-Cas1和Cas2蛋白的载体以及酶切位点。实验室现已具备相细菌培养的相关条件及所需细胞，包括PCR仪、摇床、超净台、恒温箱、琼脂糖凝胶电泳、高压破碎仪、AKTA蛋白纯化仪、SDS-PAGE相关装置、DH5alpha;感受态细胞、BL21感受态细胞等。首先PCR扩增并同源重组，之后质粒扩增并提取，然后再将质粒转入表达载体细胞中，扩大培养，加入IPTG诱导其表达。收集破碎细菌后，使用亲和镍柱层析纯化，然后浓缩蛋白，进行酶切，再用分子筛纯化蛋白。期间需要用SDS-PAGE和NANO仪监测蛋白浓度和纯度。最后放在-80℃冰箱进行冻存。下一步，测试RT-Cas1和Cas2蛋白能否在体外形成复合物及其最适盐浓度，再设计不同长度的前导序列的前间隔序列进行整合反应，并改变反应条件，如盐浓度、离子、辅助因子等寻找其最适反应条件以及最适底物。已购买尿素电泳的相关设备和试剂，有荧光扫描仪和紫外成像仪，用上述仪器检测整合反应结果。