开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
一、课题背景
1.1前言
钙蛋白酶系统广泛存在于畜禽和人类组织中。正常情况下,在维持各类细胞的结构和功能的完整性等方面具有重要作用。通过对钙蛋白酶的生理特性及其病理作用的研究,生产类似钙蛋白酶抑制蛋白的钙蛋白酶抑制剂,这将为各种疾病的治疗开辟广阔的空间。有研究表明，藤黄酸是一种组织特异性钙蛋白酶抑制剂，它可以通过特异性抑制靶向泛素特异性蛋白酶2a从而抑制肿瘤细胞的增殖以及诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡。藤黄酸在抗肿瘤方面具有多靶点、多途径交叉作用的巨大优势，这也决定着藤黄酸在抗肿瘤领域广阔的应用前景，然而具体的抗肿瘤分子机制尚且不明，疗效也不如化疗药物明显，因此它值得研究者继续开展，其分子作用机制也需要更深入研究和阐述。本研究将采用昆虫细胞表达系统来表达人钙蛋白酶2，并且纯化后采用共晶的方法得到并阐释藤黄酸与钙蛋白酶2的结合作用模式。
1.2钙蛋白酶
1.2.1钙蛋白酶简介
钙蛋白酶（Calpain）广泛存在于各组织,是半胱氨酸异源二聚体蛋白酶。[1]Calpain 由钙调蛋白和木瓜蛋白酶两者以非共价键结合而成。[2]自Guroff等首次在大鼠的脑组织中发现一种可溶的Ca2 依赖的中性蛋白酶以来，研究者们对这种蛋白酶越来越关注。[3]现在发现的哺乳动物钙蛋白酶家族成员至少由 15 种同工酶组成。根据分布特点可将其分为组织特异性和非组织特异性蛋白酶两大类。目前研究比较深入的是非组织特异性蛋白酶,已知的 2 种非组织特异性同工酶是钙蛋白酶Ⅰ（Calpain1）和钙蛋白酶Ⅱ（Calpain2）。Calpain1 可被mu;mol 水平的钙离子激活,又称mu;-Calpain; Calpain2 可被mmol 水平的钙离子激活,又称 m-Calpain。[4][5]这两种酶都有大、小两个亚基, 分子质量十分相近, 由1个具有催化活性的大亚基 (80 kD)和1个具有调节活性的小亚基(30 kD)组成。[5]大亚基和 小亚基分别含有Ⅰ~ Ⅳ 4 个结构域和 Ⅴ、Ⅵ 2个结构域。[6]由于细胞内钙离子的波动在微摩尔(mu; mol) 浓度水平以下,所以Calpain1 很可能在正常生理条件下发挥 功能,而 Calpain2则可能在病理情况(细胞内钙超载条件)下才能激活。[2]
1.2.2钙蛋白酶结构
传统的钙蛋白酶由具有催化活性的 80 000 大亚基(由 CAPN1 基因编码)与具有调节活性的 30 000小亚基(由CAPN2基因编码)组成。[6]钙蛋白酶Ⅰ（Calpain1）和钙蛋白酶Ⅱ（Calpain2）的调节亚基30kD小亚基相同，在人体中由一个单一的、位于 19 号染色体上的基因编码；催化亚基80 kD亚基不同，它们是不同的基因产物， mu; - 钙蛋白酶 80 kD 的基因位于人的 11 号染色体上，而 m-钙蛋白酶 80 kD亚基的基因在 1 号染色体上。[1]I区位于氨基端 ,占氨基酸残基的10 % , 当钙蛋白酶大亚基被Ca2 激活时，Ⅰ区自溶，这是钙蛋白酶水解的先决条件。[1][7]Ⅱ区是半胱氨酸蛋白酶与木瓜蛋白结合的区域，也是起到蛋白水解作用的主要区域。Ⅲ区含有特征性的 C2 结构域，可以通过Ca2 依赖的方式将Ca2 与磷脂相结合，此结构域很可能与抑制蛋白或激活蛋白的结合有关 , 起活性调节作用 ，可能是 Ⅳ区和Ⅵ区的调节中心。Ⅳ区位于大亚基的羧基端，是Ca2 与钙蛋白酶结合的位点，与其它钙结合蛋白如钙调素蛋白(CaM)有、原肌球蛋白(trop ininC)明显的相似性, 含有4个EF-hands结构。[8]当胞质内 Ca2 浓度升高时，Ca2 与该区的特异性钙调蛋白样位点结合，使mu;-钙蛋白酶的80 kD亚基降解为76 kD，而m-钙蛋白酶的80 kD亚基在N末端移除了20个氨基酸；同时它们的调节亚基都由无活性的30 kD转变为有活性的21kD，从而导致钙蛋白酶的构象改变，活化此酶，产生另一有活性的异二聚体。[1][8]
小亚基含2个结构域,两个结构域之间由一段富含脯氨酸的序列连接 (71-80个氨基酸残基) 。 结构域V富含甘氨酸,其余主要为疏水性氨 基酸组成,具有疏水作用，是钙蛋白酶与细胞膜或膜蛋白结合和相互作用的位点，与该酶的膜吸附特性有关。结构域VI和大亚基的结构域Ⅳ很相似,类似于CaM, 也有4个EF-hands结构,基因重组试验表明小亚基的羧基端与大亚基相结合,对形成二聚体起重要作用。[7][8]
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