注射用盐酸大观霉素细菌内毒素定量方法研究文献综述

1.背景

注射用盐酸大观霉素由土壤微生物Streptomyces spectabilis分离得到的氨基糖苷类抗菌药物，临床主要用于淋病奈瑟菌所致的尿道炎、前列腺炎、宫颈炎和直肠感染的治疗。细菌内毒素（bacterial endotoxin）是革兰阴性菌（G-）细胞壁上的特有结构，其为外源性热源，可激活中性粒细胞，使之释放出一种内源性热原质，作用于体温调节中枢引起发热,按照《中国药典》2010 年版二部要求：静脉注射剂，均应设细菌内毒素（或热原）检查项，细菌内毒素检查是控制药物注射剂重要的安全性指标。本品主要剂型为注射剂，因此，建议在原料标准中增加细菌内毒素检查，以便更好地控制原料及制剂的质量。细菌内毒素检查法是利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法，分为凝胶法和光度测定法两大类。。凝胶法为限量或半定量检测，而光度法（包括浊度法和显色基质法）为定量测定，可直观准确地反映样品中细菌内毒素含量，监测过程完全通过仪器执行，具有快速、大范围定性的特性，与凝胶法相比具有快捷、灵敏、准确等特点。随着鲎试验方法测定仪器的不断完善，内毒素测定已向定量微量方向发展，当今美国鲎试剂的应用中，超过70% 采用了定量方法。注射用盐酸大观霉素原采用凝胶法来进行限量或者半定量的检测，本课题拟建立光度法定量测定。此外，因其注射液中含有苯甲醇，会对内毒素定量产生干扰，本课题分别采用动态显色法与动态浊度法考察样品对细菌内毒素检查的干扰情况，为注射用盐酸大观霉素细菌内毒素定量方法的建立提供参考。

2.方法

2.1 细菌内毒素限值及供试品最大有效稀释倍数（MVD）的确定

细菌内毒素限值：根据公式L=K/M，L代表供试品细菌内毒素限值，K代表人体每千克体重、每小时最大可接受的内毒素剂量，注射剂为5 EU（kgh）-1，M 代表人体每千克体重、每小时可以接受的最大供试品剂量。按注射用盐酸大观霉素说明书用法用量规定，本品临床成人按60kg 体重计每次最大用量为4g , 计算得L =0.075EUmg-1。为严格用药，拟定本品内毒素限值：每1 mg 注射用盐酸大观霉素中含细菌内毒素的量应小于0.075EU。供试品最大有效稀释倍数（MVD）：按公式MVD = Lc /lambda;计算，式中L 为供试品细菌内毒素限值，c 为供试品浓度，lambda;为光度测定法中标准曲线上最低的内毒素浓度，本实验采用的动态显色法标准曲线上最低的内毒素浓度为0. 03125 EU/ml。经计算，供试品的MVD 为1500。定量法比凝胶法的最低检测限低，可选择更大的稀释倍数来排除样品的干扰。

2.2 标准曲线的建立及可靠性试验

用细菌内毒素检查用水将细菌内毒素标准品溶解稀释，使其最终溶度分别为2、0.5、0.125、0.03125 EUmL-1，分别取0.1 mL 加到细菌内毒素定量测定酶标板上再加0.1mL 鲎试剂，阴性对照管为细菌内毒素检查用水，每一浓度平行加3个孔，混匀，立即置细菌内毒素测定仪中进行检测。

表1 细菌内毒素标准曲线及可靠性分析

内毒素浓度/（EUmL-1） 平均反应时间/s 变异系数/％