干扰素产品检测中免疫检测法的应用文献综述

开题报告内容：

一、目的

利用以ELISA、免疫印迹、菌体残留蛋白检测为代表的免疫学原理检测方法对重组人干扰素alpha;1b原液的质量稳定性进行检验，并对检测条件做适当优化。通过检测方法的学习、熟练与优化能够：1）更加深刻地理解免疫学方法检测的目的、意义；2）掌握免疫学检测方法的一般操作步骤，能对检测结果能进行基本的判断分析；3）对以重组人干扰素alpha;1b为代表的蛋白质药物的质控系统与要求形成初步的体系性认识。

二、检测方法和手段

1.实验设计与原理：

这里用到以下几个检测方法：

（1）双抗体夹心ELISA用于检测经过单抗层析柱后和原液中小鼠IgG残余量，基本原理是将羊抗鼠IgG抗体预先结合到酶标板上;测定时，将待测样品(过单抗层析柱的样品或原液)和酶标抗体按一定程序与结合在固相载体上的羊抗鼠IgG抗体形成抗原抗体复合物;反应终止时，固相载体上酶标抗体被结合量(免疫复合物)与待测标本中待检抗原的量呈一定比例;经洗涤去除反应液中其他物质，加入底物进行显色，最后通过定性或定量分析有色产物量即可确定样品中待测物质含量。[2]

（2）免疫斑点法（ELISPOT）用于检测重组人干扰素alpha;1b的特异性，检测原理是加与硝酸纤维素膜上的样品与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出现紫色的斑点表明是此种蛋白即重组人干扰素alpha;1-b，通过ELISPOT酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果。[3]

（3）免疫印迹法用于检测单克隆抗体的特异性，分三个阶段进行[4].第一阶段为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：抗体等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快.此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）.第二阶段为电转移：将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压（100V）和大电流（1～2A），通电45min转移即可完成.此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见.第三阶段为酶免疫定位：将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗体的固相载体）依次与特异性抗原和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色.常用的HRP底物为3,3-二氨基联苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈蓝紫色）.阳性反应的条带清晰可辨，并可根据SDS-PAGE时加入的分子量标准，确定各组分的分子量.本法综合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性，是一个有效的分析手段广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性.