Toll样受体激动剂对肝癌细胞系干性标志的影响文献综述

研究目的

目前，肝癌是全球发病率第五位、死亡率第二位的常见恶性肿瘤。包括我国在内的东亚、东南亚等部分国家和地区是肝癌高发区，每年的新增病例占全球总数的50% 以上。 通过影像学检查与肿瘤标志物的测定，对肝癌进行早期诊断排查是控制疾病的有利措施。而对于已确诊的患者，手术切除、肝脏移植、介入治疗则是其首选治疗方案。但是，由于肝癌的高复发率、高转移率、预后不佳，患者术后5年的生存率仍低于10%。因此，急需进一步完善肝癌理论，阐明其发病机制，为临床肝癌治疗提供新的导向和依据。

虽然，对肝癌患者进行放化疗治疗可以使一部分患者体内的肿瘤组织缩小，甚至达到完全缓解，但是由于肿瘤干细胞无法被常规的放化疗杀死，这是肿瘤复发及转移的主要原因。肿瘤干细胞（cancer stem cells， CSCs /tumor-initiatingcells，T-IC）是指极小一群存在于肿瘤组织中具有自我更新、自我无限增殖并具有多向分化潜能的细胞。传统认为，肿瘤是由体细胞突变而成的，每个肿瘤细胞都具有无限增殖的能力，但近年来的研究表明，并非所有的肿瘤细胞都是能无限制增殖的。研究发现，在所有的肿瘤中都可能存在着一小部分细胞具有类似干细胞的特殊功能，这一假说不久在血液系统肿瘤中得到证实，随后在乳腺癌、脑肿瘤、 肺癌和结肠癌等实体肿瘤中也发现了肿瘤干细胞的存在。近年来的研究表明，肝癌中也存在着一群具有干细胞特征、能自我更新、自我无限增殖并具有多向分化潜能的细胞，即肝癌干细胞( liver cancer stem cells， LCSCs)，因此如何有效地针对肝癌干细胞治疗是提高治疗有效率、扭转肝癌易复发转移的有效途径。这对重新认识肝癌的发生、发展、预后转归以及指导临床治疗将起到极为重要的作用。近期研究认为，公认的肝癌干细胞表面标志分子主要有CD133，CD90，CD44，EpCAM，CD13。

其中Toll样受体（Toll like receptors, TLRs）是广泛表达在免疫细胞（如巨噬细胞、树突状细胞）上的重要模式识别受体，在机体抵御外来微生物感染的天然免疫应答过程中发挥了重要作用，并间接参与调节适应性免疫应答。然而，越来越多的研究证实，TLRs 亦在肿瘤细胞中广泛表达，而且其功能因肿瘤类型及TLRs 类别的不同而有所差异。因此，基于TLRs 激动剂的具有免疫激活效应的免疫制剂逐渐受到科学家们的重视，相关的TLRs激动剂或其类似物也已经用于一些恶性疾病的预防和治疗。例如，一种TLR7激动剂的模拟小分子类似物，咪喹莫特，已经批准用于基底细胞癌的治疗。OM-174，一种基于 TLR4 激动剂的模拟物，正处于针对实体瘤治疗的临床研究阶段。研究发现，某些类型的肿瘤细胞中 TLRs 的激活参与了细胞本身的凋亡，死亡过程。如 TLR3 的配体 poly I:C 可以显著诱导多种类型肿瘤细胞的凋亡；TLR2激动剂BLP可以增强T细胞过继免疫治疗小鼠胶质瘤。本实验室的研究发现，肝癌细胞胞内TLR9的活化介导了细胞的凋亡。反之，一些肿瘤细胞表面 TLRs 的活化则参与了肿瘤细胞的恶性增殖、侵袭、迁移、耐药及免疫逃逸的生物学过程中。肺癌细胞表面 TLR4 的活化会促进免疫负调分子的产生和释放进而介导免疫逃逸；卵巢癌细胞表面 TLR4 的活化则介导了其增殖及多药耐药的产生。在动物模型中进行的一项研究发现，肠道有害菌的自身成分脂多糖（LPS）可以通过激活肝细胞的TLR4通路促进了肝癌的发展。临床研究发现，绝大多数慢性肝脏疾病患者体内存在肠道菌群失调的现象。由于肝脏在机体中所处的特殊生理环境，不可避免的长期受到来自肠道有害菌群的侵袭。TLR4 激动剂LPS广泛参与肝癌细胞的增殖、侵袭、迁移等过程并发挥一定的促进作用。临床数据显示，肿瘤部位TLR4 高表达的肝细胞癌（HCC）患者术后生存率明显低于TLR4 低表达患者。由此可见， TLR4 在肝癌的发生发展过程中发挥了重要作用。

本研究拟利用分子生物学手段，通过大量体外实验，研究不同的TLRs激动剂对肝癌细胞的干性标志分子的变化情况，初步探讨TLRs激动剂靶向肝癌干细胞分子用于肝癌治疗的可行性，为临床肝癌治疗及新型靶向治疗药物的研发提供有益参考。

研究方法

1.以几种常见的人和鼠肝癌细胞系（HepG2，Hepa1-6，PLC/PRF/5，HepG2.2.15）为模型，采用半定量RT-PCR法检测TLRs mRNA 的表达水平; 通过 western-blot 实验及荧光定量 PCR 法检测肝癌细胞表面的 TLR2，TLR3，TLR4，TLR9是否是功能性表达，筛选不同的肝癌细胞系表达的TLRs；

2.分别用TLR2激动剂Pam3CSK4，TLR3激动剂Poly I：C，TLR4激动剂LPS，TLR9激动剂CpG对方法1筛选的肝癌细胞系进行刺激，采用MTT方法检测细胞的增殖;

3.采用Annexin V/PI 双染法检测不同的TLRs激动剂对肝癌细胞系凋亡的影响；