- 研究背景
1975年Caswell等通过向小鼠体内注射卡介苗后用LPS处理，发现小鼠血清里出现了一种活性因子，因其可以引起肿瘤细胞坏死，而对正常的细胞无毒性作用，被称为肿瘤坏死因子[1]。肿瘤坏死因子主要有三种亚型：TNF-alpha;，TNF—beta;，TNF-gamma;。肿瘤坏死因子alpha;(TNF-alpha;)是一种主要由活化的T细胞、巨噬细胞、NK细胞分泌的细胞因子，具有多种不同的生物学功能[2]。TNF-alpha;能参与慢性炎症调节，而慢性炎症在肿瘤发生和进展中具有重要作用。TNF-alpha;还可以通过Snail或ZEB1/ZEB2途径诱导EMT，从而增加肿瘤细胞的侵袭特性[3]。由此可见，TNF-alpha;的表达与肿瘤发生、转移密切相关。现有的TNF-alpha;抗体在肿瘤治疗中面临以下问题：与血液性肿瘤相比，实体肿瘤结构相对复杂，肿瘤组织渗透性差、作用时间较短[4]，因此，提高抗体在肿瘤组织内部的渗透性是一个关键环节。而已上市的TNF—alpha;抗体药物空间结构较大，不利于在肿瘤内部发挥作用。
1989年，Ward等通过克隆重链抗体的可变区得到只由一个重链可变区组成的单域抗体—VHH抗体（variable domain of heavy chain of heavy chain antibody，VHH），因其晶体结构直径2.5nm、长4 nm，称为纳米抗体。纳米抗体小的分子量、较强的水溶性和稳定性以及抗原识别能力，易于生产等特点使其在生物技术和医学中具有较高的应用价值[5]。主要的应用体现在以下几个方面：第一，中和细胞因子和可溶性蛋白。传统细胞因子抗体对牛皮癣、风湿性关节炎等自身免疫性疾病的治疗取得了良好的效果。这些抗体的成功应用提出了从骆驼体内得到更小的细胞因子中和单域抗体的需求，通过实验发现与传统的TNFalpha;中和抗体英夫利昔和阿达木单抗相比，该双价单域抗体中和效率更高。第二，抑制白细胞胞外酶活性，白细胞能分泌多种胞外酶，这些胞外酶在炎症和凋亡细胞信号通路中起着重要作用。一般用来抑制白细胞胞外酶活性的物质主要是抗体和小分子抑制剂，但小分子化学物质具有特异性较低的缺点，而VHH单域抗体具有结合酶活性中心的优点，因此常常选用VHH单域抗体阻断这些酶的活性。第三，靶向胞内抗原，一般情况下，蛋白不能穿透细胞膜进入细胞内，所以抗体很难接触胞内抗原[6]。目前采取两种策略促进单域抗体与胞内靶标抗原结合：一种是把单域抗体与介导跨膜转运的相关蛋白信号肽进行融合；另一种是将携带有单域抗体的编码序列的载体转染到细胞内，与胞内靶标蛋白共表达。因为单域抗体在不同的细胞环境内，包括胞质、内质网、核内等都可以进行正常的折叠，所以基于细胞转染的策略更加适合单域抗体靶向胞内抗原。第四，肿瘤靶向免疫诊断治疗，具备高抗原亲和力和良好的组织渗透性，并使正常组织受到的放射损伤降到最低特点的理想显影剂能快速而准确地在体内检测出肿瘤所在位置[7-10]。本课题主要是纳米抗体第四个方面的应用。为了获得高活性靶向人TNFalpha;的纳米抗体蛋白，我们构建了高活性 TNFalpha; 纳米抗体表达系统，为今后自身免疫性疾病药物的开发提供支持。
二．研究目的
本研究用已获取的TNF-alpha;纳米抗体的基因片段，构建真核表达载体pPICZalpha;-anti-TNF-alpha;，并转入毕赤酵母中，成功构建了该蛋白的表达系统，为今后研究抗体活性奠定了基础。
三．实验步骤
1. pPICZalpha;A-anti- TNF-VHH 纳米抗体酵母表达载体的构建
1.1 PCR扩增anti-TNF-alpha;-VHH 片段
用以已经构建好的pcDNA6-Anti-TNF-alpha; 重组质粒为模板，合成分别含XbaⅠ酶 和XhoⅠ酶切位点的引物进行PCR扩增目的基因片段。将通过上述实验获得的PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶中电压条件为100V的条件下电泳30min电泳结束后切下目的条带，使用事先准备好的DNA胶回收试剂盒回收所需的目的基因。
1.2构建pPICZalpha;-Anti-TNF-alpha;重组质粒
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