重组Ta1-mCH3的纯化研究文献综述

课题背景：

蛋白质药物可分为多肽和基因工程药物、单克隆抗体和基因工程抗体、重组疫苗。与以往的小分子药物相比, 蛋白质药物具有高活性、特异性强、低毒性、生物功能明确、有利于临床应用的特点。由于其成本低、成功率高、安全可靠, 已成为医药产品中的重要组成部分。[1]

胸腺肽是由胸腺的组织上皮细胞分泌的一组小分子活性肽,能通过影响淋巴细胞以及IL-2和NK细胞等因子的活性来调节机体的免疫功能。胸腺肽的有效组分主要包括胸腺素alpha;1、胸腺生成素、胸腺体液因子和血清胸腺因子，其在机体内的分泌及活性随年龄、光照、激素和微量元素水平的变化而发生改变。[2]

胸腺肽alpha;家族:Goldstein等人通过对胸腺五肽进一步分离得到胸腺肽alpha;l(thymosinalpha;1,Talpha;l),Talpha;1是一种主要针对T细胞的免疫增强剂，是TF5的主要活性成分[3]。实验表明人工合成及工程菌表达的Talpha;l,具有和机体中分离提取的胸腺肽alpha;l同样的生物学活性，其主要作用是促进淋巴细胞生成，调节机体的细胞免疫功能[4]。也有研究表明，Talpha;1对于黑色素瘤和严重脓毒症,有着良好的免疫作用机制。[5]

Talpha;1由28个氨基酸组成，其氨基酸序列为：Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala- Glu-Asn。分子量3108. 37，等电点 为 4. 2。胸腺肽alpha;1分子中不含半胱氨酸，因此无二硫键。Talpha;1无糖基化， N-端的乙酰化是其唯一的修饰，但乙酰基的存在与否对 Talpha;1 生物活性并无显著影响。生物体外活性测定表明，Talpha;1更耐酸、耐碱、耐热，且活性为 TF5( 胸腺五肽) 的10 ～ 1 000 倍。Talpha;1 空间结构与其存在的介质相关[6]。

本实验中采用pET载体，pET 系列表达载体是一种高效的大肠杆菌表达系统[7]，特异性的识别pET 表达载体中的T7 启动子序列, 从而高效的表达目的重组蛋白。

pET32a和pET28a是常用的表达载体，pET32a载体上有His蛋白标签，含有His蛋白标签的蛋白可以通过镍柱纯化。镍柱纯化原理含His蛋白标签的蛋白在Ni柱中与Ni就结合了，杂蛋白多数流出，少量杂蛋白也挂在柱上。这时候用不同终浓度的咪唑溶液梯度洗脱，一般从0、20mM、40mM......100mM开始洗脱。咪唑加入之后，会和蛋白争夺与Ni的结合位点，杂蛋白和目的蛋白会在不同的浓度被洗脱下来，将不同浓度的洗脱液收集起来并标记，每管取少部分SDS-PAGE电泳确定目的蛋白洗脱下来的梯度从而达到纯化蛋白目的。

pET28a载体上不含有His蛋白标签，故不能用镍柱纯化蛋白，纯化时采用proA柱子过柱纯化，其纯化原理是抗原-抗体反应，利用抗原-抗体特异性结合的原理将目的蛋白特异性吸附在柱子上，与杂蛋白分开，后将目的蛋白从柱子上洗脱下来。

不同的表达载体有不同的诱导表达机制，对于同一表达载体来说，不同的诱导剂对其诱导效果也不一样，本实验中采用两种诱导剂诱导目的蛋白，对比两种诱导剂对两个质粒载体的诱导效果。

免疫印迹法 (Western blotting) 是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术。免疫印迹法具有分析容量大、敏感度高、特异性强等优点，是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用的方法，如组织抗原的定性定量检测、多肽分子的质量测定及病毒的抗体或抗原检测等。其方法是将蛋白质转移到膜上，得到蛋白印迹，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。由于蛋白质分子印迹聚合物具有高度选择吸附性，能专一性识别蛋白质模板分子，是较为常用的蛋白质检测手段。[8]