酸性α-糖苷酶活性测定方法的研究文献综述

一、研究的问题

GAA酶替代疗法是目前治疗糖原累积病Ⅱ型的最有希望的方法，并且美国FDA已经批准上市了第一个重组GAA酶-myozyme以用于该病的治疗，赛诺菲等国际制药巨头已经花费大量人力物力财力用于开发研究GAA酶工业化的生产工艺。但目前在实际生产条件下针对GAA酶活力的研究报道较少，因此，本课题主要研究GAA酶活力的影响因素，为确定酸性alpha;-糖苷酶酶学性质的研究提供基础，为大规模生产酸性alpha;-糖苷酶孤儿药（Myozyme和Lumizyme）提供理论支持。

二、采用的研究手段

GAA酶活性测定方法主要有4-MU-Glc法。GAA酶催化底物4-MU-Glc反应产生荧光产物4-MU，荧光强度与4-MU的含量成正比。以每毫升 GAA在37℃条件下每小时可催化产生的4-MU的量为一个酶活单位，即nmol/hr/ml。测试样品时平行加入序列量的4-MU标准品以绘制标准曲线。通过SoftMax Pro计算机软件，使用四参数拟合回归模型绘制标准曲线，通过测试样品与阳性对照的荧光值（RFU）与同一板上标准曲线荧光值（RFU）值的对比，计算测试样品与阳性对照中4-MU的量。根据测试样品中GAA所释放4-MU的量，计算测试样品中GAA的酶活力（nmol/hr/ml）。

三、研究内容

GAA酶具有良好的应用前景，但是目前还没有具体报道在实际制药工厂环境条件下GAA酶促反应的特性的相关文献，因此研究GAA酶学性质具有重要的意义。本研究课题研究的主要内容如下：

1．GAA酶促反应最适pH的研究

利用乙酸-乙酸钠缓冲液配制不同的pH的酶促反应环境，研究在其他外部环境不变的情况下例如温度，酶添加量，酶促反应时间等，不同pH条件下GAA酶促反应的活力，寻找酶促反应的最适pH。

2．GAA酶促反应pH稳定性研究

将GAA酶储存在不同pH条件下，在不同的时间点取出测定GAA酶活力，研究GAA酶促反应对于不同pH的稳定性规律。