开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
课题背景：目前临床使用的肝素产品，主要从可食用动物组织(如猪肠粘膜和牛肺)中提取[5]。虽然提取方法简单易行,但随着市场需求不断增加,仅利用提取的肝素已经不能满足需求。与此同时, 动物来源的肝素常常存在诸多安全隐患。如2007年由于治疗过程中使用了污染的肝素，引发了极其严重的医疗事故，造成近百人死亡。导致肝素在诸多国家被召回，许多亚洲国家也有波及，这次悲剧反应了肝素供应链的脆弱[6-7]。为此，如何安全、有效地获取肝素类药物，是急需解决的问题。目前最为成功的是采用化学方法合成肝素类似物, 已有商品化的药物Arixtra（黄达肝素钠）成功上市[8-9]。其是经过较长化学步骤合成的硫酸化五糖。然而,化学合成过程复杂且成本高,市场竞争力差。然而利用微生物来源的heparosan 为前体，采用化学酶法合成具有抗凝活性的硫酸化五糖前景十分光明[7]。该方法不但克服了动物来源肝素的安全性问题，同时相对于生产过程极其复杂且产率低的化学合成法有较明显的优势，因此，越来越多的研究者目光都汇聚在这个研究领域[10-11]。
肝素前体多糖是细菌的荚膜多糖，在脊椎动物和一些软体动物中也均有发现，其结构为葡萄糖醛酸和乙酰氨基葡萄按摩尔比1:1交替连接。其独特的分子结构十分类似于肝素的多糖骨架，不同点在于该多糖不含硫酸基团，并且糖链中糖醛酸为葡萄糖醛酸而不是艾杜糖醛酸[12]。近年来数个科研团队已经成功利用heparosan多糖，经一系列的硫酸化及异构化修饰后体外合成肝素类似物[13-14]。
现阶段通常采用微生物发酵获得肝素前体多糖，主要涉及三种细菌酶合成系统：多杀性巴斯德菌D型（PmHS1、PmHS2），大肠杆菌K5 （KfiA,KfiC）[15]、副鸡禽杆菌基因型II （CcbF1 , CcbF2）[16]。与大肠杆菌K5相比，巴斯德菌D型荚膜合成能力较强，合效率高，更为经济实用。但由于细菌酶系统之间存在众多差异，不同菌种发酵生产的heparosan多糖，其产量和多糖分子量都有较大差异。巴斯德菌D型生成的多糖的分子量为200-300kDa，而大肠杆菌K5发酵产生的多糖，其平均分子量在15kDa左右。后者糖单元数更加接近于生物体产生的肝素。因此，通常情况下多采用大肠杆菌E.coli K5来发酵生产肝素前体多糖[17]。随着人们对肝素前体多糖研究的不断深入，根据现实需求和现有技术手段对其结构进行定向地改造和修饰，制备出具有特定生物活性的肝素前体多糖衍生物，这个研究方向具有十分广阔的前景.
对大肠杆菌E.coli K5的形态特征及生理特性进行了解，是进行后续发酵生产肝素前体多糖的基础。微生物的新陈代谢与产物合成都需要从外界不断地吸收营养物质，因此菌株培养基的组成和配比对微生物生长繁殖、产量高低、分离纯化工艺的选择都会产生重大的影响[52]。其中，全合成培养基是指以已知成分的化学药品所配成的培养基，目前培养已有一些微生物培养使用这种培养基。除了培养基外，培养条件的差异对微生物的生长繁殖、产物合成、后期分离纯化也会产生很大的影响。本文研究了影响heparosan产率的相关因素，利用硫酸咔唑比色测定法对发酵液中肝素前体多糖进行定量分析，以确定菌株的肝素前体多糖积累能力。
实验流程：
1.1.菌种的活化、保藏
菌种的活化：购置于ATCC的E.coli大肠杆菌保存在冻干管中，初次使用时菌种为冻干颗粒。在超净台内无菌条件下，打开瓶盖并用灭菌的镊子取出一个小珠，尽快盖好瓶盖将其放回-30℃低温冰箱保存。将小珠滴入到1mL无菌生理盐水中，轻微摇晃使其充分溶解，用接种环沾取微量菌液，划线法接种于固体培养基表面，37℃培养过夜。在活化好的固体培养基表面选取形态好，生长旺盛的菌落，用接种环挑去少量菌体将其接种到装有200mL肉汤培养基的500mL三角烧瓶中扩大培养。培养条件为温度37℃、转速240rpm、培养时间24小时。
菌种的保藏:5个月以内短期使用的菌种一般采用甘油管保存，其方法是在确保无菌条件下，用移液枪吸取1mL活化的菌液至容量为2mL的无菌EP管中，加入20ul无菌甘油，确保甘油终溶度为16%，将菌液与甘油充分混合，然后将分装好装有菌液的EP管放置于-30℃冰箱冻藏。两年内长期保存菌种一般采用液体石蜡封存法：在长有菌种的斜面培养基试管中加入10mL灭菌100%液体石蜡，用密封胶带紧密包裹橡胶塞与试管口封口处，确保隔绝空气，最后将将保藏管至于-30℃冰箱冻存。
1.2.发酵过程相关参数的测定与考察
菌体生长曲线的绘制
菌体浓度的计算
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