电泳介导微分析法简单快速测定组织蛋白酶B的含量文献综述

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

一、课题背景

组织蛋白酶B（Cathepsin B）在哺乳动物细胞中表达且普遍存在，被认为是体内最活跃的蛋白酶，其涉及许多生理过程的调节，如细胞内蛋白质分解代谢，激素激活和免疫反应中抗原的加工等^[1，2]。最近研究表明组织蛋白酶B可以作为一种生物标记物，通过检测它的含量，对某些癌症的发生和进程进行监控或预测，如子宫内膜癌，膀胱细胞癌等^[3，4]。目前关于组织蛋白酶B的测定的方法大致有以下几种，比色法、Q-PCR和western blot联用的方法以及ELISA法，这些方法在酶反应的测定实验中都存在一些缺陷，比如比色法需要大量的样本消耗还有很长的孵育时间，western需要多种特异性的抗体，较长的分析时间，ELISA实验过程中易出现假阳性结果且干扰因素较多等。以上的问题可以通过电泳介导微分析方法克服，毛细管电泳自动化程度高、样品消耗量小，分析时间短、有利于高通量筛选，在酶反应实验中具有独特优势^[5-7]。本课题的计划是，酶在较低浓度下，酶的浓度与催化的底物量成正比，生成的产物跟酶的浓度也成正比，利用不同浓度酶和底物的反应，通过电泳介导的微分析法建立测定组织蛋白酶B含量的方法，然后用于测定实际样本中组织蛋白酶B的含量。

1. 要解决的问题

利用酶和底物的特异性反应，建立Cat B酶的电泳介导微分析法，实现生物样本中Cat B酶的快速定量检测，用于监测肿瘤等疾病的发生发展。

1. 可行性分析

电泳介导的微分析法是通过利用各个物质在电场作用下电泳淌度的差异来实现反应物的混合和酶促反应的发生。其对酶活性的影响很小，利于为酶促反应构建相对优良的条件，确保实验的顺利进行。在前期的实验探索阶段，已经确定了酶反应的最佳温度，最佳缓冲液浓度、pH，最佳孵育时间等条件，进展比较顺利，可行性强。

1. 研究方法和内容

缓冲液（BGE）的配置：1、分别精密称取一定量的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠，将其溶解于一定量的水中，形成终浓度为 10 mM 溶液。之后，在 pH 仪的监测下，将磷酸氢二钠溶液缓慢逐滴滴入磷酸二氢钠溶液中，充分搅拌混匀，至目标 pH 终止，分管保存。

酶溶液和底物产物溶液的配置：1、组织蛋白酶 B 完全溶解于 pH 5.0 的磷酸盐缓冲液当中，形成不同浓度的酶溶液，以 20 mu;L/管的量分装于 0.2 mL的离心管中，放入-20℃冰箱内冷冻保存，每次使用前拿出一小管，避免酶反复冻融而导致的活性丧失；2、精密称取底物和产物，然后完全溶解于水溶液中，形成浓度为 1mg/mL 的母液，放于 4 ℃冰箱内冷藏保存。每次使用前先将其稀释至需要浓度，再进样。
毛细管预处理：截取所需长度新毛细管，首先通入 1 M 氢氧化钠溶液冲洗 1 h，再通入去离子水冲洗 0.5 h，之后用 0.1 M 的盐酸溶液冲洗 0.5 h，进一步去除氢氧化钠溶液的残留，最后再通入去离子水冲洗 0.5 h，完成对毛细管的预处理。在每次使用毛细管之前，最好再通入一段时间的缓冲溶液，使毛细管达到平衡后再使用。每进样 5 次，用 0.1 M 氢氧化钠溶液、甲醇溶液各冲洗 3 min，之后用缓冲溶液冲洗 10 min，再进行下一步实验。另外，每天实验结束之后，需要用甲醇溶液以及去离子水各冲洗 15 min。这些都是为了尽可能去除吸附在毛细管壁上的蛋白质，以防对以后的实验造成影响，以提高毛细管的使用寿命。

毛细管电泳分离方法：熔融石英毛细管内径 50 mu;m，总长度 33.5 cm，有效长度 25 cm；样品从进样端按照酶-底物-抑制剂的顺序分别在 50 mbar 的压力下进样 3 s，三个样品完成进样后，正负压交替，进样缓冲溶液，重复三次，以使各种溶液充分混合。进样每一种物质后，都要将毛细管进样端插入到水中，避免酶、底物之间交叉污染。之后关闭电压，孵育 5 min，之后在 15 kV 电压下进行多组分分离，将卡盒温度设置为 30 ℃，检测波长设定为 345 nm，通过实验可发现，该波长为底物和产物的特征吸收。

通过改变Cat B酶的浓度，得到的产物峰面积也会不同，以此建立一条Cat B酶浓度-产物峰面积的标准曲线，可用于生物样本中Cat B酶的定量测定。在实际样本的选择上，首先会采用已报道的以Cat B酶作为生物标记物的疾病患者或者动物模型样本验证方法的可靠性。然后用于发现是否可作为其他潜在疾病生物标记物。

五、工作计划